Vi beskriver en metode for å generere menneskelige motorenheter i kommersielt tilgjengelige mikrofluidiske enheter ved å kokulturere menneskeskapte pluripotente stamcelleavledede motoriske nevroner med humane primære mesoangioblast-avledede myotuber som resulterer i dannelse av funksjonelt aktive nevromuskulære veikryss.
Nevromuskulære veikryss (NMJs) er spesialiserte synapser mellom axonen til den nedre motoriske nevronen og muskelen som letter engasjementet av muskelkontraksjon. I motoriske nevronsykdommer, som amyotrofisk lateral sklerose (ALS) og spinal muskelatrofi (SMA), degener NMJs, noe som resulterer i muskelatrofi og progressiv lammelse. Den underliggende mekanismen for NMJ-degenerasjon er ukjent, hovedsakelig på grunn av mangel på overførbare forskningsmodeller. Denne studien hadde som mål å skape en allsidig og reproduserbar in vitro-modell av en menneskelig motorenhet med funksjonelle NMJs. Derfor ble menneskeskapt pluripotent stamcelle (hiPSC)-avledede motoriske nevroner og humane primære mesoangioblast (MAB)-avledede myotuber samkulturert i kommersielt tilgjengelige mikrofluidiske enheter. Bruken av fluidisk isolerte mikrorom gjør det mulig å opprettholde cellespesifikke mikromiljø samtidig som celle-til-celle-kontakt tillates gjennom mikrogroover. Ved å bruke en kjemosaktisk og volumetrisk gradient ble veksten av motoriske nevron-neuritter gjennom mikrogroovene som fremmer myotube interaksjon og dannelsen av NMJs stimulert. Disse NMJene ble identifisert immunocytokjemisk gjennom samlokalisering av motorisk nevron presynaptisk markørsynaptofysin (SYP) og postsynaptisk acetylkolinreseptor (AChR) markør α-bungarotoxin (Btx) på myotuber og karakterisert morfologisk ved hjelp av skanning elektronmikroskopi (SEM). Funksjonaliteten til NMJs ble bekreftet ved å måle kalsiumresponser i myotubes ved depolarisering av motornevronene. Motorenheten som genereres ved hjelp av standard mikrofluidiske enheter og stamcelleteknologi kan hjelpe fremtidig forskning med fokus på NMJs innen helse og sykdom.
NMJs letter kommunikasjonen mellom lavere spinalmotoriske nevroner og skjelettmuskulaturfibre gjennom frigjøring av nevrotransmittere1. I motoriske nevronforstyrrelser som ALS og SMA degener NMJs, noe som forårsaker en forstyrrelse i kommunikasjonen med musklene2,3,4,5,6,7. Dette resulterer i at pasienter gradvis mister muskelfunksjonen, noe som fører til at de er rullestolbundne og til slutt avhengige av respiratorisk livsstøtte på grunn av progressiv atrofi av vitale muskelgrupper som membranen. De eksakte underliggende mekanismene som er ansvarlige for dette dype tapet av NMJs i disse lidelsene er ukjente. Mange studier har blitt gjort på transgene dyremodeller, noe som har gitt oss litt innsikt i patogenesen av NMJ degenerasjon5,6,8,9,10,11. For å forstå patologien og motvirke denervasjonen, er det imidlertid viktig å ha et menneskelig system, noe som gir full tilgjengelighet.
Her beskriver protokollen en relativt enkel måte å generere menneskelige NMJs gjennom co-culturing av hiPSC-avledede motoriske nevroner og humane primære MAB-avledede myotuber ved hjelp av kommersielt tilgjengelige mikrofluidiske enheter. Bruken av mikrofluidikk for å polarisere og fluidisk isolere somas og axoner av nevroner har vært kjent siden den første beskrivelsen av ‘Campenot’ kamrene12 på slutten av 1970-tallet. Siden da har flere mikrofluidiske design blitt fabrikkert, inkludert kommersielle alternativer. Enhetene som brukes i denne protokollen inneholder to rom, og hvert rom består av to brønner koblet til en kanal13. De to rommene er speilet og forbundet med flere mikrogroover. Disse mikrogroovene har en størrelse som letter nevrittvekst samtidig som den opprettholder fluidisk isolasjon mellom de to rommene gjennom et kapillært hydrostatisk trykk13,14. Ved hjelp av dette systemet er det mulig å dyrke motoriske nevroner i ett rom og muskelceller i det andre, hver i deres spesifikke kulturmedium, samtidig som det letter en fysisk forbindelse gjennom nevritter som passerer gjennom mikrogroovene og engasjerer seg med muskelcellene. Denne modellen gir et fullt tilgjengelig og tilpasningsdyktig in vitro-system av en menneskelig motorenhet, som kan brukes til å studere tidlig NMJ-patologi i sykdommer som ALS og SMA.
Protokollen beskriver en relativt brukervennlig metode, som genererer menneskelige motorenheter med funksjonelle NMJs i kommersielt tilgjengelige mikrofluidiske enheter på mindre enn 30 dager. Det er beskrevet hvordan NMJs kan vurderes morfologisk gjennom standardteknikker som ICC og SEM og funksjonelt gjennom live-celle kalsiumopptak.
En stor fordel med denne protokollen er bruk av stamcelleteknologi. Dette gir full tilpasningsevne der NMJs kan evalueres i både helse og sykdom, uavhengig av giverprofilen. Modellen har vist seg allerede vellykket og gunstig i ALS-forskning, der vi identifiserte svekkelser i nevrittutvekst,gjenvekst og NMJ-tall som nye fenotyper på grunn av mutasjoner i FUS-genet18. Med denne modellen er det mulig å utvide forskningen til å omfatte sporadiske former for ALS, hvor etiologien er ukjent, ved å bruke iPSCer fra sporadiske ALS-pasienter. Dette gir en fordel i forhold til tradisjonelle dyremodeller, som er avhengige av transgen overekspressering av muterte gener for å rekapitulere menneskelig sykdom23,24. I tillegg muliggjør vårt fullt menneskelige system potensiell recapitulation av menneskelig spesifikk fysiologi og sykdom. Tidligere studier viste forskjellene mellom gnager og human NMJ morfologi25, noe som antyder at forsiktighet må implementeres ved bruk av gnagere for å adressere menneskelig NMJ-patologi. Selv om dette systemet er et relativt enkelt in vitro-oppsett, som mangler kompleksiteten til en in vivo-modell, var det mulig å demonstrere at NMJ-morfologien som vises i mikrofluidiske enheter lignet NMJs av menneskelige amputater25. Videre tillater denne modellen NMJ-evaluering under NMJ-dannelse og modning, og potensielt avslører tidlige sykdomsfenotyper, som er fraværende, uidentifiserbare eller oversett i menneskelige post-mortem prøver.
MASTER gir et gyldig alternativ for å generere myotubes, selv om deres begrensede overlevelse på 10 dager er en ulempe med systemet. Myotube-overlevelsen er avhengig av deres tilknytning til overflaten, som sannsynligvis er kompromittert av spontane sammentrekninger av myofibers. Etter mer enn 10 dager vil de fleste myotubes ha løsnet, noe som gjør NMJ-kulturen ubrukelig. Ideelt sett vil myotubene også bli generert fra iPSCer. Dagens protokoller har imidlertid vist seg vanskelige å reprodusere26 på grunn av variasjon i fusjonsindeksen27,28,29,30.
Ved å bruke kommersielt tilgjengelige mikrofluidiske enheter genererte vi et standardisert system, som er fullt tilgjengelig. Andre NMJ-modeller finnes31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42. Imidlertid er de vanligvis avhengige av enkeltrom, som mangler oppdeling og fluidisk isolasjon mellom celletyper, eller på skreddersydde kulturfartøy, noe som reduserer tilgjengeligheten og potensielt også reproduserbarheten. De mikrofluidiske enhetene som brukes til denne protokollen kan kjøpes med mikrogroover av forskjellige lengder, noe som muliggjør videre analyse som axonal transport43,44 eller axotomy18,45,46 undersøkelser. Den fluidiske isolasjonen mellom rom muliggjør videre inndelt legemiddelbehandling av enten motoriske nevroner eller myotuber, noe som kan være gunstig i terapiutviklingen. Flere selskaper som spesialiserer seg på mikrofluidikk har dukket opp, som har åpnet opp for et stort utvalg av enhetsdesign og funksjoner, noe som ytterligere fremmer tilgjengeligheten for in vitro-forskning.
Til slutt har vi utviklet en protokoll som gir en pålitelig, allsidig og enkel metode for å dyrke menneskelige motorenheter med funksjonelle NMJs.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Nikky Corthout og Sebastian Munck fra LiMoNe, Research Group Molecular Neurobiology (VIB-KU Leuven) for deres råd om levende celle kalsium forbigående fluorescensopptak. Denne forskningen ble støttet av Fulbright-kommisjonen til Belgia og Luxembourg, KU Leuven (C1 og “Opening the Future” Fund), VIB, Agency for Innovation by Science and Technology (IWT; SBO-iPSCAF), “Fund for Scientific Research Flanders” (FWO-Vlaanderen), Target ALS, ALS Liga België (A Cure for ALS), den belgiske regjeringen (Interuniversity Attraction Poles Program P7/16 initiert av Det belgiske føderale vitenskapspolitiske kontor), Thierry Latran Foundation og “Association Belge contre les Maladies neuro-Musculaires” (ABMM). T.V. og J.B. støttes av ph.d.-stipender tildelt av FWO-Vlaanderen.
α-bungarotoxin (Btx) Alexa fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | B35451 | Antibody (1:1000) |
Acetic Acid | CHEM-Lab NV | CL00.0116.1000 | Coating component. H226, H314. P280 |
Aclar 33C sheet (SEM sheet) | Electron Microscopy Sciences | 50425-25 | Thickness: 7.8 mil |
Agrin (recombinant human protein) | R&D systems | 6624-AG-050 | Media supplement |
Alexa fluor IgG (H+L) 488 donkey-anti rabbit | Thermo Fisher Scientific | A21206 | Antibody (1:1000) |
Alexa fluor IgG (H+L) 555 donkey-anti goat | Thermo Fisher Scientific | A21432 | Antibody (1:1000) |
Alexa fluor IgG (H+L) 555 donkey-anti mouse | Thermo Fisher Scientific | A31570 | Antibody (1:1000) |
Alexa fluor IgG (H+L) 647 donkey-anti mouse | Thermo Fisher Scientific | A31571 | Antibody (1:1000) |
Ascorbic acid | Sigma | A4403 | Media component |
βIII-tubulin (Tubulin) | Abcam | ab7751 | Antibody (1:500) |
β-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 31350010 | Media component. H317. P280. |
B-27 without vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587-010 | Media component |
BDNF (brain-derived neurotrophic factor) | Peprotech | 450-02B | Growth factor |
bFGF (recombinant human basic fibroblast growth factor) | Peprotech | 100-18B | Growth factor |
Choline acetyltransferase (ChAT) | Millipore | ab144P | Antibody (1:500) |
Collagen from calfskin | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | Coating component |
CNTF (ciliary neurotrophic factor) | Peprotech | 450-13B | Growth factor |
DAPI Nucblue Live Cell Stain ReadyProbes reagent | Thermo Fisher Scientific | R37605 | Immunocytochemistry component |
DAPT | Tocris Bioscience | 2634 | Media supplement |
Desmin | Abcam | Ab15200 | Antibody (1:200) |
DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | Media component |
DMSO | Sigma | D2650-100ML | Cryopreservation component. H315, H319, H335. P280. |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | no calcium, no magnesium |
Ethanol | VWR | 20.821.296 | Sterilization. H225. P280 |
Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | Media component |
Fluo-4 AM live cell dye | Thermo Fisher Scientific | F14201 | Calcium imaging dye |
Fluorescence Mounting Medium | Dako | S3023 | Immunocytochemistry component |
GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor) | Peprotech | 450-10B | Growth factor |
Glutaraldehyde | Agar Scientific | R1020 | Fixation component. EUH071, H301, H314, H317, H330, H334, H410. P280. |
Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050122 | Media component |
Human alkaline phosphatase | R&D systems | MAB1448 | Antibody |
ImageJ software | NIH | ICC analysis | |
IMDM | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | Media component |
Insulin transferrin selenium | Thermo Fisher Scientific | 41400045 | Media component |
Islet-1 | Millipore | ab4326 | Antibody (1:400) |
Knockout serum replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828-028 | Cryopreservation component |
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma | L2020-1MG | Coating component and media supplement |
Leica SP8 DMI8 confocal microscope | Leica | ICC confocal microscopy | |
L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | Media component |
Myogenin (MyoG) | Abcam | Ab124800 | Antibody (1:500) |
Myosin heavy chain (MyHC) | In-house, SCIL | Antibody (1:20) | |
N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | Media component |
Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | Coating and media component |
Neurofilament heavy chain (NEFH) | Abcam | AB8135 | Antibody (1:1000) |
Nikon A1R confocal microscope | Nikon | Live-cell calcium imaging microscopy | |
NIS-Elements AR 4.30.02 software | Nikon | Live-cell calcium imaging analysis | |
Non-essential amino acids | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Media component |
Normal donkey serum | Sigma | D9663-10ML | Immunocytochemistry component |
Olig2 | IBL | 18953 | Antibody (1:1000) |
Parafilm M | Sigma | P7793-1EA | Storing equipment |
Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Fixation component. H302, H312, H315, H317, H319, H332, H335, H341, H350. P280. |
Penicillin/Streptomycin (5000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | Media component |
Petri dish (3 cm) | nunc | 153066 | Diameter: 3 cm |
Petri dish (10 cm) | Sarstedt | 833.902 | Diameter: 10 cm |
Plate (6-well) | Cellstar Greiner bio-one | 657160 | Culture plate |
Pluronic F-127 | Thermo Fisher Scientific | P3000MP | Fluo-4 dye solvent |
Poly-L-ornithine (PLO) | Sigma | P3655-100MG | Coating component |
Potassium chloride | CHEM-Lab NV | CL00.1133.1000 | Calcium imaging reagent |
Retinoic acid | Sigma | R2625 | Media supplement. H302, H315, H360FD, H410. P280. |
RevitaCell supplement | Thermo Fisher Scientific | A2644501 | ROCK inhibitor solution |
Smoothened agonist | Merch Millipore | 566660 | Media supplement |
Sodium cacodylate buffer | Sigma | C0250 | Fixation component. H301, H331, H350, H410. P280. |
Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | Media component |
Synaptophysin (SYP) | Cell Signaling | 5461S | Antibody (1:1000) |
T75 flask | Sigma | CLS3276 | Culture plate |
Titin | Developmental Studies Hybridoma Bank | 9D10 | Antibody (1:300) |
Triton X-100 | Sigma | T8787-250ML | Immunocytochemistry component. H302, H315, H318, H319, H410, H411. P280 |
TrypLE express | Thermo Fisher Scientific | 12605010 | MAB dissociation solution |
Tubocyrarine hydrochloride pentahydrate | Sigma | T2379-100G | Acetylcholine receptor blocker. H301. P280. |
XonaChips pre-assembled microfluidic device | Xona Microfluidics | XC150 | Microgroove length: 150 μm |
Xona Silicone microfluidics device | Xona Microfluidics | SND75 | Microgroove length: 75 μm |