Method Article

Plaquing di herpes simplex virus

DOI:

10.3791/62962

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November 5th, 2021

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1Towson University Herpes Virus Lab, Department of Biological Sciences, Towson University, 2Towson University Department of Chemistry, Towson University, 3Department of Oncology, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Molecular Biology, Biochemistry, and Bioinformatics Program, Towson University

In This Article

Summary

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Plaquing è un metodo di routine utilizzato per quantificare i virus vivi in una popolazione. Sebbene il plaquing sia spesso insegnato in vari curricula di microbiologia con batteri e batteriofagi, il plaquing dei virus dei mammiferi è più complesso e richiede tempo. Questo protocollo descrive le procedure che funzionano in modo affidabile per il lavoro regolare con i virus dell'herpes simplex.

Abstract

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Esistono numerosi protocolli pubblicati per plaquing dei virus, inclusi riferimenti all'interno della letteratura primaria per la metodologia. Tuttavia, l'applicazione di virus può essere difficile da eseguire, richiedendo attenzione alle sue specifiche e perfezionamento. È un metodo incredibilmente impegnativo da padroneggiare per i nuovi studenti, principalmente perché richiede un'attenzione meticolosa ai dettagli più minuti. Questa dimostrazione di plaquing herpes simplex virus dovrebbe aiutare coloro che hanno lottato con la visualizzazione del metodo, in particolare le sue sfumature, nel corso degli anni. Mentre questo manoscritto si basa sugli stessi principi della metodologia standard di plaquing, differisce in quanto contiene una descrizione dettagliata di (1) come gestire al meglio le cellule ospiti per evitare interruzioni durante il processo, (2) un mezzo viscoso più utile dell'agarosio per limitare la diffusione dei virioni e (3) una semplice procedura di fissazione e colorazione che produce risultati riproducibili in modo affidabile. Inoltre, il video di accompagnamento aiuta a dimostrare le distinzioni più sottili nel processo, che spesso mancano quando si istruiscono gli altri sulla conduzione di saggi di placca.

Introduction

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Gli inizi dei test della placca virale risalgono alle prime scoperte di virus nel 18901. Il virus del mosaico del tabacco è stato isolato e trasmesso per la prima volta sulle foglie di tabacco, dove le singole macchie di infezione potevano essere riconosciute e quantificate come provenienti da una singola entità virale viva2, in seguito identificata come virione2. Successivi studi seminali con batteri e batteriofagi hanno perfezionato le tecniche utilizzate per placcare questi virus, compresi i batteri nella fase intermedia della crescita, la diluizione seriale di campioni di batteriofagi e l'agar....

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Protocol

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Tutte le procedure con le cellule Vero e gli herpesvirus vivi sono state approvate dal Comitato istituzionale per la biosicurezza della Towson University. Uno schema generalizzato di queste procedure è rappresentato nella Figura 1.

1. Semina delle cellule Vero

  1. Il giorno prima di iniziare il test della placca, tripsinizzare le cellule Vero e risospenderle in Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) regolare e integrare secondo la metodologia standard di coltura cellulare19. Risospese le cellule tripsinizzate in 10 mL di DMEM per pallone T-75 delle cellule Vero c....

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Results

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La Tabella 1 mostra un esperimento che ha risultati ottimali. Tutte le diluizioni 10 volte seguono una diminuzione di circa 10 volte del numero di placca. Questi tipi di dati possono anche essere visti nella Figura 2, un vero e proprio test della placca in cui il numero numerabile di placche è caduto nell'intervallo 10-4 per tutte e tre le repliche. Lo stesso può essere visto nella Figura 3, la riga superiore, dove il numero numerabil.......

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Discussion

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Mentre i saggi della placca sono vecchi quasi quanto la coltura cellulare dei mammiferi, sembra che ogni laboratorio abbia il proprio set di protocolli per eseguire questo test di base5,6,10,11,12,13,14,15,16,20.......

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Disclosures

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Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Acknowledgements

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Ringraziamo innumerevoli studenti nei nostri laboratori (PJD e BJM) che hanno lavorato con noi nel corso degli anni perfezionando questi metodi. Un ringraziamento speciale a Stan Person, sotto la cui tutela questa metodologia è stata sviluppata per la prima volta. Questo lavoro è stato parzialmente supportato dal Fondo di supporto alla ricerca universitaria della Towson University Fisher College of Science and Math e dalla sovvenzione NIGMS Bridges to the Baccalaureate 5R25GM058264. Questo contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali del National Institutes of Health's National Institute of General Medica....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Piastre a 12 pozzettiCorning3512
Piastre a 6 pozzettiCorning3516
Alpha-MEMLonza12169F
Antibiotico/antimicoticoGibco15240096
CristalloviolettoAlfa AesarB2193214
DMEMGibco11965092
PBS di Dulbecco (no Mg++ o Ca++)Gibco14190144
Siero fetale di vitelloMillipore-SigmaTMS-013-B
L-alanil-L-glutammina (Glutamax)GibcoGS07F161BA
HemacytometerThermo Fisher02-671-54
MetilcellulosaMillipore-Sigma27-441-0
Agente quaternario (Lysol I.C.)Thermo FisherNC9645698
Trypan BlueCorning25900CI
TripsinaCytivaSH30042.01
Vero celleATCCCCL-81

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dimmock, N., Easton, A., Leppard, K. Introduction to Moden Virology. 6th end. , Wiley-Blackwell. (2007).
  2. Mahy, B., Collier, L. Topley and Wilson's Microbiology and Microbial Infections. 9th edn. 1, Arnold. (1998).
  3. Anderson, B., et al.

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Plaque AssayHerpes Simplex VirusViral PlaquingViral Titer QuantificationMethylcellulose OverlayCrystal Violet StainingSerial DilutionVero CellsAntiviral EfficacyCell Monolayer

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