基于人类原发性皮肤成纤维细胞的亨廷顿舞蹈症模型微管加端动力学可视化
Summary
该协议专门用于通过EB3蛋白转染进行微管加端可视化，以研究它们在原代细胞培养物中的动态特性。该协议是在从亨廷顿舞蹈症患者获得的人类原发性皮肤成纤维细胞上实施的。
Abstract
用荧光标记的感兴趣标记蛋白转染并结合延时视频显微镜是研究细胞骨架动态特性的经典方法。该协议为人原发性成纤维细胞转染提供了一种技术，由于原代细胞培养条件的特殊性，这可能很困难。此外，细胞骨架动态性能维持需要低水平的转染才能获得良好的信噪比，而不会导致微管稳定。重要的是要采取措施保护细胞免受光诱导的应激和荧光染料褪色的影响。在我们的工作过程中，我们测试了不同的转染方法和方案以及不同的载体，以选择适合人类原发性成纤维细胞研究的最佳条件组合。我们分析了生成的延时视频，并使用ImageJ计算了微管动力学。微管在不同细胞部分的正端动力学并不相似，因此我们将分析分为亚组 – 中心体区域，薄片和成纤维细胞的尾部。值得注意的是，该协议可用于患者样本中细胞骨架动力学的 体外 分析，从而为了解各种疾病发展的动力学迈出了下一步。
Introduction
亨廷顿舞蹈症（HD）是一种无法治愈的神经退行性病理学，由编码亨廷顿蛋白（HTT）的基因突变引起。HTT主要与囊泡和微管有关，可能参与微管依赖性转运过程1，2。为了研究突变HTT对微管动力学的影响，我们使用EB3蛋白的体外可视化，通过结合和稳定生长的正端来调节微管的动态特性。为了将荧光标记的EB3加载到人皮肤成纤维细胞中，应用质粒转染。在本研究中，我们使用从HD患者皮肤活检中获得的原发性成纤维细胞培养物。
HTT蛋白基因的突变导致聚谷氨酰胺束3的伸长。HTT在细胞内吞作用4、细胞转运1、2、蛋白质降解5等细胞过程中起作用。这些过程的很大一部分涉及细胞骨架的各种元件，包括微管。
人类原代细胞是尽可能密切地再现患者细胞中发生的事件的最佳模型。要创建这样的模型，需要从人体活检材料（例如，从手术样本中）分离细胞。所得原代细胞系适合于使用各种遗传、生化、分子和细胞生物学方法研究发病机制。此外，人类原代细胞培养物可作为创建各种转分和转基因培养物的前体6。
然而，与永生化细胞培养物相比，原代细胞的显着缺点是其传代能力有限。因此，我们建议在早期传代阶段（最多15个）使用细胞。较老的文化退化得非常快，失去了它们独特的属性。因此，新获得的原代细胞应保持冷冻以长期储存。
原代细胞培养物易受培养条件的影响。因此，它们通常需要独特的方法和生长条件的优化。特别是，我们实验中使用的人体皮肤原发性成纤维细胞对底物的要求很高。因此，我们根据实验类型使用了各种附加涂层（例如明胶或纤连蛋白）。
细胞细胞骨架决定了细胞的形状、迁移率和运动。细胞骨架的动力学对于相间和有丝分裂中的许多细胞内过程至关重要。特别是，由微管蛋白聚合的细胞骨架是高度动态和极性的结构，能够使运动蛋白介导的定向细胞内转运。微管的末端处于不断的重排中，它们的组装阶段与拆卸阶段交替，这种行为被称为”动态不稳定性“7，8，9。各种相关蛋白质改变了聚合反应的平衡，导致聚合物形成或蛋白质单体形成。微管蛋白亚基的添加主要发生在微管10的正端 。终结合（EB）蛋白家族由三个成员组成：EB1，EB2和EB3。它们充当加端跟踪蛋白（+TIPs），并通过结合和稳定其生长的正端来调节微管的动态特性11。
许多研究使用荧光分子标记的微管蛋白显微注射或转染以及延时成像和视频分析，以 在体外可视化微管 。这些方法可能是侵入性的，对细胞有害，尤其是原代人类细胞。最具挑战性的步骤是找到细胞转染的条件。我们试图在不影响活力和天然细胞形态的情况下达到尽可能高的转染水平。本研究应用经典方法研究健康供体和亨廷顿舞蹈症患者皮肤成纤维细胞微管动力学的差异。
Protocol
Representative Results
Discussion
从高质量的显微图像中可以获得更高质量的微管动力学分析结果。重要的是要观察活细胞延时成像的所有必要条件，并正确调整成像参数。使用带有玻璃底的特殊细胞培养皿（共聚焦培养皿）很重要，因为玻璃具有与塑料不同的光折射率。玻璃的厚度及其在整个区域内的均匀性也非常重要，因为这些参数对于正常的样品聚焦至关重要。违反这些参数不可避免地会导致完美对焦系统故障，从而导致?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
该研究由俄罗斯联邦科学和高等教育部资助，拨款号为075-15-2019-1669（成纤维细胞转染），由俄罗斯科学基金会资助，拨款号为19-15-00425（所有其他关于 体外培养成纤维细胞的工作）。它得到了莫斯科国立罗蒙诺索夫大学发展计划PNR5.13（成像和分析）的部分支持。作者感谢尼康卓越中心在A. N. Belozersky物理化学生物学研究所的支持。我们要特别感谢叶卡捷琳娜·塔兰（Ekaterina Taran）在配音方面的帮助。作者还感谢Pavel Belikov在视频编辑方面的帮助。手稿中的人物是用 BioRender.com 创作的。
Materials
| Instrumentation | |||
| Camera iXon DU897 EMCCD | Andor Technology | ||
| Eppendorf Centrifuge 5804 R | Eppendorf Corporate | ||
| Fluorescence filter set HYQ FITC | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| LUNA-II Automated Cell Counte | Logos Biosystems | L40002 | |
| Microscope incubator for lifetime filming | Okolab | Temperature controller H301-T-UNIT-BL-PLUS | |
| Gas controller CO2-O2-UNIT-BL | |||
| Objective lens CFI Plan Apo Lambda 60x Oil 1.4 (WD 0.13) | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Widefield fluorescence light microscope Eclipse Ti-E | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Software | |||
| Fiji (Image J version 2.1.0/1.53c) | Open source image processing software | ||
| NIS Elements | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Additional reagents | |||
| Mineral oil (Light white oil) | MP | 151694 | |
| Cell culture dish | |||
| Cell Culture Dish | SPL Lifesciences | 20035 | |
| Confocal Dish (glass thickness 170 µm) | SPL Lifesciences | 211350 | Alternative: MatTek |
| Conical Centrifuge tube | SPL Lifesciences | 50015 | |
| Cryogenic Vials | Corning-Costar | 430659 | |
| Microcentrifuge Tube | Nest | 615001 | |
| Cultivation | |||
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | |
| Dimethyl sulfoxide | PanEko |  135 |
|
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media) | PanEko | C420 |
|
| DPBS (Dulbecco's phosphate-salt solution) | PanEko | P060 |
|
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | K053/SH30071.03 | |
| Gelatin (bovine skin) | PanEko | 070 |
|
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Opti-MEM (1x) + Glutamax | Gibco | 519850026 | |
| Penicillin-streptomycin | PanEko | A063 |
|
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | |
| Transfection | |||
| Plasmid DNA with EB3-GFP | Kind gift of Dr. I. Kaverina [Vanderbilt University, Nashville] with permission from Dr. A. Akhmanova [Erasmus University, Rotterdam] |
Stepanova et al., 2003 DOI: 10.1523/JNEUROSCI.23-07-02655.2003 |
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