Visualização da dinâmica plus-end de microtúbulo no modelo de doença de Huntington baseado em fibroblastos de pele primárias humanas
Summary
Este protocolo é dedicado à visualização plus-end do microtúbulo pela transfecção de proteínaS EB3 para estudar suas propriedades dinâmicas na cultura celular primária. O protocolo foi implementado em fibroblastos de pele primários humanos obtidos de pacientes com a doença de Huntington.
Abstract
Transfecção com uma proteína marcadora fluorescente de interesse em combinação com microscopia de vídeo de lapso de tempo é um método clássico de estudar as propriedades dinâmicas do citoesqueleto. Este protocolo oferece uma técnica para transfecção do fibroblasto primário humano, que pode ser difícil devido às especificidades das condições primárias de cultivo celular. Além disso, a manutenção da propriedade dinâmica do citoesqueleto requer um baixo nível de transfecção para obter uma boa relação sinal-ruído sem causar estabilização de microtúbulos. É importante tomar medidas para proteger as células contra o estresse induzido pela luz e o desbotamento do corante fluorescente. No decorrer do nosso trabalho, testamos diferentes métodos e protocolos de transfecção, bem como diferentes vetores para selecionar a melhor combinação de condições adequadas para estudos de fibroblasto primário humano. Analisamos os vídeos resultantes do lapso de tempo e a dinâmica calculada de microtúbulos usando ImageJ. A dinâmica dos plus-ends dos microtúbulos nas diferentes partes celulares não são semelhantes, por isso dividimos a análise em subgrupos – a região centro-grande, a lamella e a cauda dos fibroblastos. Notavelmente, este protocolo pode ser usado para análise in vitro da dinâmica do citoesqueleto em amostras de pacientes, permitindo o próximo passo para entender a dinâmica do desenvolvimento de várias doenças.
Introduction
A doença de Huntington (HD) é uma patologia neurodegenerativa incurável causada por uma proteína de codificação genética de codificação de genes (HTT). O HTT está associado principalmente a vesículas e microtúbulos e provavelmente está envolvido em processos de transporte dependentes de microtúbulos1,2. Para estudar a influência do HTT mutante na dinâmica dos microtúbulos, utilizamos a visualização in vitro da proteína EB3, que regula as propriedades dinâmicas dos microtúbulos, vinculando e estabilizando o crescimento de plus-ends. Para carregar eb3 fluorescentemente rotulado em fibroblastos de pele humana, foi aplicada transfecção plasmida. Utilizou-se a cultura do fibroblasto primário obtida a partir da biópsia da pele dos pacientes HD para este estudo.
A mutação no gene da proteína HTT leva ao alongamento do trato de poliglutamina3. O HTT tem um papel em processos celulares como a endocitose4,transporte celular1,2,degradação proteica5,etc. Parte substancial desses processos envolve vários elementos do citoesqueleto celular, incluindo os microtúbulos.
As células primárias humanas são o melhor modelo para reproduzir eventos que ocorrem em células do paciente o mais próximo possível. Para criar tais modelos, é preciso isolar as células do material de biópsia humana (por exemplo, a partir de amostras cirúrgicas). A linha celular primária resultante é adequada para estudar a patogênese usando vários métodos genéticos, bioquímicos, moleculares e de biologia celular. Além disso, as culturas celulares primárias humanas servem como precursora da criação de várias culturas transdiferenciadas e transgênicas6.
No entanto, em contraste com as culturas celulares imortalizadas, a desvantagem significativa das células primárias é sua capacidade limitada de passagem. Por isso, recomendamos o uso de células na fase de passagens iniciais (até 15). Culturas mais antigas degeneram muito rapidamente, perdendo suas propriedades únicas. Assim, as células primárias recém-obtidas devem ser mantidas congeladas para armazenamento a longo prazo.
As culturas celulares primárias são suscetíveis às condições de cultivo. Portanto, muitas vezes requerem abordagens únicas e otimização de condições de crescimento. Em particular, os fibroblastos primários da pele humana usados em nossos experimentos são exigentes no substrato. Assim, utilizamos vários revestimentos adicionais (por exemplo, gelatina ou fibronectina) dependendo do tipo de experimento.
O citoesqueleto celular determina a forma da célula, mobilidade e locomoção. A dinâmica do citoesqueleto é crucial para muitos processos intracelulares tanto na interfase quanto na mitose. Em particular, o citoesqueleto polimerizado a partir de tubulina, são estruturas altamente dinâmicas e polares, permitindo o transporte intracelular direcionado mediado por proteína motora. As extremidades dos microtúbulos estão em constante rearranjo, suas fases de montagem se alternam com as fases de desmontagem, e esse comportamento é chamado de “instabilidade dinâmica”7,8,9. Várias proteínas associadas mudam o equilíbrio da reação de polimerização, levando à formação do polímero ou à formação de monômeros proteicos. A adição de subunidades de tubulina ocorre principalmente na extremidade mais alta dos microtúbulos10. A família de proteínas end-binding (EB) é composta por três membros: EB1, EB2 e EB3. Eles servem como proteínas de rastreamento plus-end (+TIPs) e regulam as propriedades dinâmicas dos microtúbulos, vinculando e estabilizando seus plus-endscrescentes 11.
Muitos estudos usam microinjeção ou transfecção de tubulina com imagem de lapso de tempo e análise de vídeo para visualizar microtúbulos in vitro. Esses métodos podem ser invasivos e prejudiciais às células, especialmente as células humanas primárias. O passo mais desafiador é encontrar condições para transfecção celular. Tentamos alcançar o mais alto nível possível de transfecção sem afetar a viabilidade e a morfologia celular nativa. Este estudo aplica o método clássico para estudar as diferenças na dinâmica dos microtúbulos nos fibroblastos de pele de doadores saudáveis e pacientes com a doença de Huntington.
Protocol
Representative Results
Discussion
Melhores resultados de qualidade para a análise dinâmica dos microtúbulos podem ser obtidos a partir de imagens microscópicas de alta qualidade. É importante observar todas as condições necessárias para a imagem de lapso de tempo das células vivas e ajustar corretamente os parâmetros de imagem. Usar pratos especiais de cultura celular com fundo de vidro (pratos confocal) é importante, já que o vidro tem um índice de luz refrativo diferente do plástico. A espessura do vidro e sua uniformidade sobre toda a su…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi financiada pelo Ministério da Ciência e Educação Superior da Federação Russa, concedendo o nº 075-15-2019-1669 (transfecção de fibroblastos), pela Fundação Russa de Ciência, conceder nº 19-15-00425 (todos os outros trabalhos sobre o cultivo de fibroblastos in vitro). Foi parcialmente apoiado pelo programa de desenvolvimento da Universidade Estadual de Moscou, PNR5.13 (imagem e análise). Os autores reconhecem o apoio do Centro de Excelência Nikon do Instituto A. N. Belozersky de Biologia Físico-Química. Queremos oferecer nossos agradecimentos especiais a Ekaterina Taran por sua ajuda com a dublagem. Os autores também agradecem a Pavel Belikov por sua ajuda na edição de vídeo. Figuras do manuscrito foram criadas com BioRender.com.
Materials
| Instrumentation | |||
| Camera iXon DU897 EMCCD | Andor Technology | ||
| Eppendorf Centrifuge 5804 R | Eppendorf Corporate | ||
| Fluorescence filter set HYQ FITC | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| LUNA-II Automated Cell Counte | Logos Biosystems | L40002 | |
| Microscope incubator for lifetime filming | Okolab | Temperature controller H301-T-UNIT-BL-PLUS | |
| Gas controller CO2-O2-UNIT-BL | |||
| Objective lens CFI Plan Apo Lambda 60x Oil 1.4 (WD 0.13) | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Widefield fluorescence light microscope Eclipse Ti-E | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Software | |||
| Fiji (Image J version 2.1.0/1.53c) | Open source image processing software | ||
| NIS Elements | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Additional reagents | |||
| Mineral oil (Light white oil) | MP | 151694 | |
| Cell culture dish | |||
| Cell Culture Dish | SPL Lifesciences | 20035 | |
| Confocal Dish (glass thickness 170 µm) | SPL Lifesciences | 211350 | Alternative: MatTek |
| Conical Centrifuge tube | SPL Lifesciences | 50015 | |
| Cryogenic Vials | Corning-Costar | 430659 | |
| Microcentrifuge Tube | Nest | 615001 | |
| Cultivation | |||
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | |
| Dimethyl sulfoxide | PanEko |  135 |
|
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media) | PanEko | C420 |
|
| DPBS (Dulbecco's phosphate-salt solution) | PanEko | P060 |
|
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | K053/SH30071.03 | |
| Gelatin (bovine skin) | PanEko | 070 |
|
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Opti-MEM (1x) + Glutamax | Gibco | 519850026 | |
| Penicillin-streptomycin | PanEko | A063 |
|
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | |
| Transfection | |||
| Plasmid DNA with EB3-GFP | Kind gift of Dr. I. Kaverina [Vanderbilt University, Nashville] with permission from Dr. A. Akhmanova [Erasmus University, Rotterdam] |
Stepanova et al., 2003 DOI: 10.1523/JNEUROSCI.23-07-02655.2003 |
Riferimenti
- Engelender, S., et al. Huntingtin-associated Protein 1 (HAP1) Interacts with the p150 Glued Bubunit of Dynactin. Human Molecular Genetics. 6 (13), 2205-2212 (1997).
- Caviston, J. P., Ross, J. L., Antony, S. M., Tokito, M., Holzbaur, E. L. Huntingtin facilitates dynein/dynactin-mediated vesicle transport. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (24), 10045-10050 (2007).
- MacMillan, J. C., et al. Molecular analysis and clinical correlations of the Huntington’s disease mutation. The Lancet. 342 (8877), 954-958 (1993).
- Proskura, A. L., Vechkapova, S. O., Zapara, T. A., Ratushniak, A. S. Protein-protein interactions of huntingtin in the hippocampus. Biologia Molecolare. 51 (4), 647-653 (2017).
- Steffan, J. S., et al. The Huntington’s disease protein interacts with p53 and CREB-binding protein and represses transcription. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6763-6768 (2000).
- Nekrasov, E. D., et al. Manifestation of Huntington’s disease pathology in human induced pluripotent stem cell-derived neurons. Molecular Neurodegeneration. 11 (1), 1-15 (2016).
- Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
- Walker, R. A., et al. Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies. The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1437-1448 (1988).
- Desai, A., Mitchison, T. J. Microtubule polymerization dynamics. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 13 (1), 83-117 (1997).
- Allen, C., Borisy, G. G. Structural polarity and directional growth of microtubules of Chlamydomonas flagella. Journal of Molecular Biology. 90 (2), 381-402 (1974).
- Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
- Shelden, E., Wadsworth, P. Observation and quantification of individual microtubule behavior in vivo: microtubule dynamics are cell-type specific. Journal of Cell Biology. 120 (4), 935-945 (1993).
- O’Brien, E. T., Salmon, E. D., Walker, R. A., Erickson, H. P. Effects of magnesium on the dynamic instability of individual microtubules. Biochimica. 29 (28), 6648-6656 (1990).
- Drechsel, D. N., Hyman, A. A., Cobb, M. H., Kirschner, M. W. Modulation of the dynamic instability of tubulin assembly by the microtubule-associated protein tau. Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1141-1154 (1992).
- Gildersleeve, R. F., Cross, A. R., Cullen, K. E., Fagen, A. P., Williams, R. C. Microtubules grow and shorten at intrinsically variable rates. Journal of Biological Chemistry. 267 (12), 7995-8006 (1992).
- Penazzi, L., Bakota, L., Brandt, R. Microtubule dynamics in neuronal development, plasticity, and neurodegeneration. International Review of Cell and Molecular Biology. 321, 89-169 (2016).
- van de Willige, D., Hoogenraad, C. C., Akhmanova, A. Microtubule plus-end tracking proteins in neuronal development. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (10), 2053-2077 (2016).
- Applegate, K. T., et al. plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. Journal of Structural Biology. 176 (2), 168-184 (2011).
- Komarova, Y. A., Vorobjev, I. A., Borisy, G. G. Life cycle of MTs: persistent growth in the cell interior, asymmetric transition frequencies and effects of the cell boundary. Journal of Cell Science. 115 (17), 3527-3539 (2002).
- Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., vanden Broek, B., Jalink, K. Optimizing imaging conditions for demanding multi-color super resolution localization microscopy. PLoS One. 11 (7), 0158884 (2016).
- Dixit, R., Cyr, R. Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy. The Plant Journal. 36 (2), 280-290 (2003).
- Grzelak, A., Rychlik, B., Bartosz, G. Light-dependent generation of reactive oxygen species in cell culture media. Free Radical Biology and Medicine. 30 (12), 1418-1425 (2001).
