JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscienze

Magnetisk isolering av mikrogliaceller från nyfödd mus för primära cellkulturer

Published: July 25, 2022
doi:
10.3791/62964
, , , , , , , , , ,
1NeuroDiderot, Inserm UMR-1141, Hôpital Robert Debré 48,Université de Paris, 2Department of anesthesia and critical care,APHP-Sorbonne university

Summary

Primära mikrogliakulturer används ofta för att utvärdera nya antiinflammatoriska molekyler. Detta protokoll beskriver en reproducerbar och relevant metod för att magnetiskt isolera mikroglia från nyfödda ungar.

Abstract

Microglia, som hjärnboende makrofager, är grundläggande för flera funktioner, inklusive svar på miljöstress och hjärnhomeostas. Microglia kan anta ett stort spektrum av aktiveringsfenotyper. Dessutom är microglia som stöder proinflammatorisk fenotyp associerad med både neurodevelopmental och neurodegenerativa störningar. In vitro- studier används ofta i forskning för att utvärdera potentiella terapeutiska strategier i specifika celltyper. I detta sammanhang är det mer relevant att studera mikroglial aktivering och neuroinflammation in vitro med hjälp av primära mikroglialkulturer än mikrogliala cellinjer eller stamcellsbaserade mikroglia. Användningen av vissa primära kulturer kan dock drabbas av brist på reproducerbarhet. Detta protokoll föreslår en reproducerbar och relevant metod för att magnetiskt isolera mikroglia från nyfödda valpar. Mikroglial aktivering med användning av flera stimuli efter 4 h och 24 h genom mRNA-uttryckskvantifiering och en Cy3-pärlfagocytisk analys demonstreras här. Det aktuella arbetet förväntas ge en lätt reproducerbar teknik för att isolera fysiologiskt relevant mikroglia från juvenila utvecklingsstadier.

Introduction

Microglia är de makrofagliknande cellerna i centrala nervsystemet som härrör från erytropoietiska föregångare till äggula som migrerar till neuroepitelet under tidig embryonal utveckling1. Förutom deras immunitetsfunktioner spelar de också en viktig roll under neuroutveckling, särskilt för synaptogenes, neuronal homeostas och myelinering2. I vuxen ålder utvecklar microglia långa cellulära processer för att skanna miljön kontinuerligt. Vid homeostasbrott som hjärnskada eller hjärnsjukdom kan microglia ändra sitt morfologiska utseende för att anta en amoeboidform, migrera till det skadade området, öka och frigöra många cytoprotektiva eller cytotoxiska faktorer. Microglia har heterogena aktiveringstillstånd beroende på deras utvecklingsstadium och vilken typ av skada som uppstått 3,4,5. I denna studie klassificeras dessa aktiveringstillstånd i stort sett i tre olika fenotyper: proinflammatorisk / fagocytisk, antiinflammatorisk och immunreglerande, med tanke på att situationen i verkligheten sannolikt kommer att vara mer komplex6.

Att studera mikrogliaaktivering in vivo och screening för neuroprotektiva strategier i tidiga stadier av hjärnans utveckling kan vara utmanande på grund av (1) djurens bräcklighet före avvänjning och (2) det låga antalet mikrogliaceller. Därför används in vitro-studier på mikroglia i stor utsträckning för toxicitet 7,8,9, neuroprotektiva strategier5,10,11,12,13,14 och samkulturer 15,16,17,18,19,20,21 . In vitro-studier kan använda antingen mikrogliala cellinjer, stamcellsderiverade mikroglia eller primär mikrogliakultur. Alla dessa tillvägagångssätt har fördelar och nackdelar, och valet beror på den ursprungliga biologiska frågan. Fördelarna med att använda primära mikrogliakulturer är den homogena genetiska bakgrunden, patogenfri historia och kontroll av den tid då mikroglia stimuleras efter djurdöd22.

Under åren utvecklades olika metoder (flödescytometri, skakning eller magnetisk märkning) för odling av primär mikroglia från gnagare, både nyfödda och vuxna 23,24,25,26,27,28,29. I detta arbete utförs mikrogliaisolering från musnyfödda ungar med hjälp av tidigare beskriven magnetaktiverad cellsorteringsteknik med hjälp av mikropärlbelagd antimus-CD11b25,27,29. CD11b är en integrinreceptor uttryckt vid ytan av myeloida celler, inklusive mikroglia. När det inte finns någon inflammatorisk utmaning i hjärnan är nästan alla CD11b + -celler microglia30. Jämfört med andra tidigare publicerade metoder 23,24,25,26,27,28,29, balanserar detta protokoll omedelbara ex vivo mikroglialaktiveringsanalyser och vanlig in vitro primär mikroglialkultur. Således isoleras mikroglia (1) efter födseln (P) 8 utan myelinavlägsnande, (2) odlas utan serum och (3) exponeras antingen för siRNA, miRNA, farmakologisk förening och / eller inflammatoriska stimuli endast 48 timmar efter hjärnisolering. Var och en av dessa tre aspekter gör det nuvarande protokollet relevant och snabbt. Först och främst möjliggör användningen av pediatrisk mikroglia att erhålla dynamiska och reaktiva livskraftiga celler i odling utan att kräva ett ytterligare demyelineringssteg som potentiellt kan modifiera mikroglial reaktivitet in vitro. Detta protokoll syftar till att komma så nära den fysiologiska miljön i microglia som möjligt. Faktum är att microglia aldrig stöter på serum, och detta protokoll kräver inte heller användning av serum. Dessutom hindrar exponering av mikroglia så tidigt som 48 timmar efter odling dem från att förlora sina fysiologiska förmågor.

Protocol

Protokollet godkändes och alla djur hanterades enligt de institutionella riktlinjerna från Institut National de la Santé et de la Recherche Scientifique (Inserm, Frankrike). Magnetisk isolering av mikroglia från hjärnan hos 24 OF1-musvalpar (både manliga och kvinnliga) vid P8, uppdelad i 6-brunns-, 12-brunns- eller 96-brunnsplattor, presenteras. Det experimentella arbetet utfördes under en huva för att upprätthålla sterila förhållanden. 1. Beredning av sterila lösningar för…

Representative Results

Microglia är den CNS-bosatta makrofagen som aktiveras när den utsätts för miljöutmaningar (trauma, giftiga molekyler, inflammation) 4,5,6,34 (figur 3A). In vitro-studier på mikroglia används ofta för att utvärdera cellautonoma mekanismer relaterade till dessa miljöutmaningar och karakterisera aktiveringstillstånd efter farmakologisk eller geneti…

Discussion

Det aktuella arbetet presenterar en primär mikroglialcellodling med magnetiskt sorterade CD11b + -celler. Förutom den mikrogliala funktionella utvärderingen (RT-qPCR och fagocytiska analyser) bestämdes också mikroglialodlingsrenhet.

Klassiska mikrogliacellkulturer genereras vanligtvis från P1- eller P2-gnagare nyfödda hjärna och samodling med astrocyter i minst 10 dagar. Microglia separeras sedan mekaniskt med hjälp av en orbital shaker. Metoden att isolera och odla microglia in v…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Figurer skapades med BioRender. Forskningen finansieras av Inserm, Université de Paris, Horizon 2020 (PREMSTEM-874721), Fondation de France, Fondation ARSEP, Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, Fondation Grace de Monaco och ett ytterligare bidrag från Investissement d’Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS och Investissement d’Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E.

Materials

Anti mouse ACSA-2 PE Vio 615 Miltenyi Biotec 130-116-246
Anti mouse CD11b BV421 Sony Biotechnology 1106255
Anti mouse CD45 BV510 Sony Biotechnology 1115690
Anti mouse CX3CR1 PE Cy7 Sony Biotechnology 1345075
Anti mouse NeuN PE Milli-Mark FCMAB317PE
anti mouse O4 Vio Bright B515 Miltenyi Biotec 130-120-016
BD Cytofix/Cytoperm permeabilization kit BD Biosciences 554655
Bovine Serum Albumin Miltenyi Biotec 130-091-376
CD11b (Microglia) MicroBeads, h, m Miltenyi Biotec 130-093-634
Confocal microscope Leica TCS SP8
D-PBS (10x) Thermo Scientific 14200067
EDTA Sigma-Aldrich E1644
Falcon Cell culture 12-well plate, flat bottom + lid Dutscher 353043
Falcon Cell culture 96-well plate, flat bottom + lid Dutscher 353072
Falcon tubes 50 mL Dutscher 352098
Fc blocking reagent (Mouse CD16/32) BD Biosciences 553142
Fluorescence microscope Nikon ECLIPSE TE300
gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubes) Miltenyi Biotec 130-096-334
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters Miltenyi Biotec 130-096-427
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10x Thermo Scientific 14065049
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10x Thermo Scientific 14185045
iQ SYBR Green Supermix Bio-rad 1725006CUST
Iscript c-DNA synthesis Bio-rad 1708890
Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red Sigma-Aldrich L2776-1mL
Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O55:B5 Sigma-Aldrich L2880
Macrophage-SFM serum-free medium Thermo Scientific 12065074
MACS BSA Stock Solution Miltenyi Biotec 130-091-376
MACS SmartStrainers (70 μm), 4 x 25 pcs Miltenyi Biotec 130-110-916
Mouse IgG1 PE Millipore MABC002H
Mouse IgG2a PE Cy7 Sony Biotechnology 2601265
Mouse IL1 beta Miltenyi Biotec 130-101-684
Multi-24 Column Blocks Miltenyi Biotec 130-095-691
MultiMACS Cell24 Separator Miltenyi Biotec
Neural Tissue Dissociation Kit – Papain Miltenyi Biotec 130-092-628
Nucleocounter NC-200 Chemometec
Nucleospin RNA Plus XS Macherey Nagel 740990.5
Nun EZFlip Top Conical Centrifuge Tubes Thermo Scientific 362694
OPTILUX Petri dish – 100 x 20 mm Dutscher 353003
Pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL) Thermo Scientific 15140122
Rat IgG2b, k BV421 BD Biosciences 562603
Rat IgG2b, k BV510 Sony Biotechnology 2603230
REA control (S) PE vio 615 Miltenyi Biotec 130-104-616
REA control (S) Vio Bright B515 Miltenyi Biotec 130-113-445
Recombinant Mouse IFN-gamma Protein R&D System 485-MI
Recombinant Mouse IL-10 Protein R&D System 417-ML
Recombinant Mouse IL-4 Protein R&D System 404-ML
RIPA Buffer Sigma-Aldrich R0278
Viability probe (FVS780) BD Biosciences 565388
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).
  2. Wright-Jin, E. C., Gutmann, D. H. Microglia as dynamic cellular mediators of brain function. Trends in Molecular Medicine. 25 (11), 967-979 (2019).
  3. Hellstrom Erkenstam, N., et al. Temporal characterization of microglia/macrophage phenotypes in a mouse model of neonatal hypoxic-ischemic brain injury. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 286 (2016).
  4. Chhor, V., et al. Role of microglia in a mouse model of paediatric traumatic brain injury. Brain, Behavior, and Immunity. 63, 197-209 (2017).
  5. Van Steenwinckel, J., et al. Decreased microglial Wnt/beta-catenin signalling drives microglial pro-inflammatory activation in the developing brain. Brain. 142 (12), 3806-3833 (2019).
  6. Chhor, V., et al. Characterization of phenotype markers and neuronotoxic potential of polarised primary microglia in vitro. Brain, Behavior, and Immunity. 32, 70-85 (2013).
  7. Di Pietro, P., et al. Bisphenol A induces DNA damage in cells exerting immune surveillance functions at peripheral and central level. Chemosphere. 254, 126819 (2020).
  8. Roque, P. J., Dao, K., Costa, L. G. Microglia mediate diesel exhaust particle-induced cerebellar neuronal toxicity through neuroinflammatory mechanisms. Neurotoxicology. 56, 204-214 (2016).
  9. Yun, H. S., Oh, J., Lim, J. S., Kim, H. J., Kim, J. S. Anti-inflammatory effect of wasp venom in BV-2 microglial cells in comparison with bee venom. Insects. 12 (4), 297 (2021).
  10. Nair, S., et al. Lipopolysaccharide-induced alteration of mitochondrial morphology induces a metabolic shift in microglia modulating the inflammatory response in vitro and in vivo. Glia. 67 (6), 1047-1061 (2019).
  11. Fleiss, B., et al. The anti-inflammatory effects of the small molecule pifithrin-micro on BV2 microglia. Developmental Neuroscience. 37 (4-5), 363-375 (2015).
  12. Dean, J. M., et al. Microglial MyD88 signaling regulates acute neuronal toxicity of LPS-stimulated microglia in vitro. Brain, Behavior, and Immunity. 24 (5), 776-783 (2010).
  13. Tang, Y., Wolk, B., Nolan, R., Scott, C. E., Kendall, D. A. Characterization of subtype selective cannabinoid CB2 receptor agonists as potential anti-inflammatory agents. Pharmaceuticals (Basel). 14 (4), 378 (2021).
  14. Liu, C. P., et al. miR146a reduces depressive behavior by inhibiting microglial activation. Molecular Medicine Reports. 23 (6), 463 (2021).
  15. Aquino, G. V., Dabi, A., Odom, G. J., Zhang, F., Bruce, E. D. Evaluating the endothelial-microglial interaction and comprehensive inflammatory marker profiles under acute exposure to ultrafine diesel exhaust particles in vitro. Toxicology. 454, 152748 (2021).
  16. You, J. E., Jung, S. H., Kim, P. H. The effect of Annexin A1 as a potential new therapeutic target on neuronal damage by activated microglia. Molecules and Cells. 44 (4), 195-206 (2021).
  17. Xie, Z., et al. By regulating the NLRP3 inflammasome can reduce the release of inflammatory factors in the co-culture model of tuberculosis H37Ra strain and rat microglia. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 637769 (2021).
  18. Ogunrinade, F. A., et al. Zanthoxylum zanthoxyloides inhibits lipopolysaccharide- and synthetic hemozoin-induced neuroinflammation in BV-2 microglia: roles of NF-kappaB transcription factor and NLRP3 inflammasome activation. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 73 (1), 118-134 (2021).
  19. Fernandez-Arjona, M. D. M., Leon-Rodriguez, A., Lopez-Avalos, M. D., Grondona, J. M. Microglia activated by microbial neuraminidase contributes to ependymal cell death. Fluids Barriers CNS. 18 (1), 15 (2021).
  20. Du, S., et al. Primary microglia isolation from postnatal mouse brains. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e62237 (2021).
  21. Boccazzi, M., et al. The immune-inflammatory response of oligodendrocytes in a murine model of preterm white matter injury: the role of TLR3 activation. Cell Death & Disease. 12 (2), 166 (2021).
  22. Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. An overview of in vitro methods to study microglia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 242 (2018).
  23. Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
  24. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
  25. Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. Isolation and culture of microglia. Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70 (2019).
  26. Schroeter, C. B., et al. One brain-all cells: A comprehensive protocol to isolate all principal CNS-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 651 (2021).
  27. Harms, A. S., Tansey, M. G. Isolation of murine postnatal brain microglia for phenotypic characterization using magnetic cell separation technology. Methods in Molecular Biology. 1041, 33-39 (2013).
  28. Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. Journal of Immunological Methods. 486, 112834 (2020).
  29. Montilla, A., Zabala, A., Matute, C., Domercq, M. Functional and metabolic characterization of microglia culture in a defined medium. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 22 (2020).
  30. Krishnan, M. L., et al. Integrative genomics of microglia implicates DLG4 (PSD95) in the white matter development of preterm infants. Nature Communications. 8 (1), 428 (2017).
  31. Bokobza, C., et al. miR-146b protects the perinatal brain against microglia-induced hypomyelination. Annals of Neurology. 91 (1), 48-65 (2021).
  32. Villapol, S., et al. Early sex differences in the immune-inflammatory responses to neonatal ischemic stroke. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 3809 (2019).
  33. Rosiewicz, K. S., et al. Comparison of RNA isolation procedures for analysis of adult murine brain and spinal cord astrocytes. Journal of Neuroscience Methods. 333, 108545 (2020).
  34. Fleiss, B., et al. Microglia-mediated neurodegeneration in perinatal brain injuries. Biomolecules. 11 (1), 99 (2021).
  35. Pawelec, P., Ziemka-Nalecz, M., Sypecka, J., Zalewska, T. The Impact of the CX3CL1/CX3CR1 axis in neurological disorders. Cells. 9 (10), 2277 (2020).
  36. Reynolds, R., Cenci di Bello, I., Dawson, M., Levine, J. The response of adult oligodendrocyte progenitors to demyelination in EAE. Progress in Brain Research. 132, 165-174 (2001).
  37. Duan, W., et al. Novel insights into NeuN: From neuronal marker to splicing regulator. Molecular Neurobiology. 53 (3), 1637-1647 (2016).
  38. Kantzer, C. G., et al. Anti-ACSA-2 defines a novel monoclonal antibody for prospective isolation of living neonatal and adult astrocytes. Glia. 65 (6), 990-1004 (2017).
  39. Lee, S., Lee, D. K. What is the proper way to apply the multiple comparison test. Korean Journal of Anesthesiology. 71 (5), 353-360 (2018).
  40. Chao, C. C., Hu, S., Molitor, T. W., Shaskan, E. G., Peterson, P. K. Activated microglia mediate neuronal cell injury via a nitric oxide mechanism. Journal of Immunology. 149 (8), 2736-2741 (1992).
  41. Boje, K. M., Arora, P. K. Microglial-produced nitric oxide and reactive nitrogen oxides mediate neuronal cell death. Brain Research. 587 (2), 250-256 (1992).
  42. Biber, K., Owens, T., Boddeke, E. What is microglia neurotoxicity (Not). Glia. 62 (6), 841-854 (2014).
  43. Biber, K., Neumann, H., Inoue, K., Boddeke, H. W. Neuronal ‘On’ and ‘Off’ signals control microglia. Trends in Neurosciences. 30 (11), 596-602 (2007).
  44. Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
  45. Boucsein, C., Kettenmann, H., Nolte, C. Electrophysiological properties of microglial cells in normal and pathologic rat brain slices. European Journal of Neuroscience. 12 (6), 2049-2058 (2000).
  46. Beutner, C., et al. Unique transcriptome signature of mouse microglia. Glia. 61 (9), 1429-1442 (2013).
  47. Schmid, C. D., et al. Differential gene expression in LPS/IFNgamma activated microglia and macrophages: in vitro versus in vivo. Journal of Neurochemistry. 109, 117-125 (2009).
  48. Srivastava, P. K., et al. A systems-level framework for drug discovery identifies Csf1R as an anti-epileptic drug target. Nature Communications. 9 (1), 3561 (2018).

Tags

MicrogliaMagnetic Cell SortingNeonate MousePrimary Cell CultureCD11bCell DissociationHBSSSorting BufferCell SeparationCell Count
check_url/it/62964?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Bokobza, C., Jacquens, A., Zinni, M., Faivre, V., Hua, J., Guenoun, D., Userovici, C., Mani, S., Degos, V., Gressens, P., Van Steenwinckel, J. Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures. J. Vis. Exp. (185), e62964, doi:10.3791/62964 (2022).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image