쥐 뒷다리 모델에서 동맥 형성 중 백혈구 모집을 모니터링하기 위한 다광자 생체 내 이미징
Summary
백혈구와 혈소판의 모집은 동맥 형성 동안 측부 동맥의 효과적인 성장에 필요한 필수 구성 요소를 구성합니다. 다광자 현미경은 동맥 형성 중 백혈구 모집 및 유출을 연구하기 위해 생체 내에서 높은 시공간 분해능과 더 적은 광독성으로 세포 역학을 추적하는 효율적인 도구입니다.
Abstract
동맥 형성은 성장하는 측부 혈관의 혈관 주위 공간으로의 백혈구 및 혈소판 모집에 크게 의존합니다. 동맥 형성에서 측부 동맥 및 백혈구를 분석하기 위한 표준 접근법은 생체 외 (면역-) 조직학적 방법론입니다. 그러나 이 기술은 혈류, 전단 응력, 세포-세포 상호 작용 및 입자 속도와 같은 동적 과정을 측정할 수 없습니다. 이 논문은 생체 내 이미징을 활용하여 동맥 형성 동안 성장하는 측부 동맥의 생체 내 과정을 모니터링하는 프로토콜을 제시합니다. 여기에 설명된 방법은 역학 측정을 위한 신뢰할 수 있는 도구이며 다광자 여기 현미경으로 제공하는 광세포 독성을 최소화하면서 고대비 분석을 제공합니다. 성장하는 측부 동맥을 분석하기 전에, 대퇴 동맥의 일측성 결찰에 의해 마우스의 내전근에서 동맥 형성이 유도되었습니다.
결찰 후, 기존의 측부 동맥은 전단 응력 증가로 인해 성장하기 시작했습니다. 수술 24시간 후, 측부 동맥 위의 피부와 피하 지방을 제거하여 추가 분석을 위한 주머니를 만들었습니다. 생체 내 이미징 동안 혈류와 면역 세포를 시각화하기 위해 CD41-플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)(혈소판) 및 CD45-피코에리트린(PE)(백혈구) 항체를 마우스의 꼬리 정맥에 삽입된 카테터를 통해 정맥내(i.v.) 주사했습니다. 이 기사에서는 동맥 형성과 관련된 과정을 연구하기 위해 일반적으로 사용되는 정적 생체 외(면역) 조직학적 분석에 대한 대안 또는 생체 내 보완으로 생체 내 다광자 이미징을 소개합니다. 요약하면, 이 논문은 동맥 형성의 뒷다리 모델에서 면역 세포 이동, 혈류 및 전단 응력을 조사하기 위한 새롭고 역동적인 생체 내 방법을 설명하며, 이는 평가 가능성을 현저하게 향상시킵니다.
Introduction
최근 몇 년 동안 집중적인 연구 관심에도 불구하고 허혈성 심장 질환 및 뇌졸중과 같은 심혈관 질환은 여전히 전 세계적으로 주요 사망 원인입니다1. 이러한 질환에 대한 현재 치료법은 경피적 경혈관 성형술, 경피적 경혈관 관상동맥 성형술 또는 우회 수술과 같은 고도 침습적 치료법이다2. 따라서 대안적인 비침습적 치료 옵션의 개발이 시급합니다. 신체는 협착되거나 폐색된 혈관 주위에 자연적인 우회로를 만들어 중단된 혈류를 협착의 원위 부분으로 리디렉션할 수 있습니다. 이 과정을 동맥 형성2라고 합니다. 최근의 많은 연구에 따르면 증가된 유체 전단은 동맥 형성 동안 중요한 역할을 하는 백혈구 모집에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다3. 동맥 형성 중 백혈구 모집을 분석하기 위한 주요 현재 옵션은 생체 외 (면역) 조직학적 분석 또는 형광 활성화 세포 분류(FACS) 방법론입니다4. 동맥 형성 중 백혈구 역학을 평가할 수 있도록 이 논문은 다광자 현미경을 사용한 생체 내 이미징 프로토콜을 제시합니다.
백혈구는 동맥 형성 과정에서 모집되는 주요 혈액 세포이다3. 이 프로토콜은 쥐 뒷다리 허혈 모델 5,6을 사용하여 대퇴 동맥 결찰술(FAL)에 의한 동맥 형성 유도 후 24시간 후에 측부 동맥에 주입된 항-CD45-PE 항체로 표지된 부착 백혈구의 크롤링을 보여주기 위해 다광자 이미징을 사용합니다. 대안적으로, 생체 외에서 면역 세포를 표지하고 생체 내 현미경을 이용한 혈관신생에 관한 연구에서 볼 수 있듯이 생쥐에 조심스럽게 주입할 수 있다7. 혈관 및 동맥 내부의 혈류는 CD41-FITC(혈소판 표지), 덱스트란-FITC(혈장) 또는 혈관 트리의 일부 기저막에 존재하는 콜라겐 유형 1을 시각화하는 2차 고조파 생성(SHG)에 의해 시각화될 수 있습니다. SHG는 다광자 여기의 독특한 자유 라벨링 효과입니다. 다광자 이미징은 조직에 해를 끼치지 않고 레이저 파워 여기로 세포를 활성화하지 않고 장기적인 세포 추적을 가능하게 합니다. 다광자 현미경은 형광단을 최소한의 광독성으로 조직/기관 깊숙이 여기시킬 수 있는 능력으로 인해 살아있는 동물의 형광 표지된 세포 및 구조를 시각화하기 위해 선택되는 이미징 방법입니다8.
펨토초 간격 내에서 전달되는 펄스와 함께 조정된 적외선 레이저를 사용하면 초점면에서만 형광색소를 여기시키고 초점면 위와 아래에는 여기가 없습니다(8). 따라서 다광자 현미경은 장기 내부의 역동적인 생물학적 사건을 연구하기 위해 높은 시공간 해상도, 더 적은 광 손상 및 증가된 조직 침투 이미징을 허용합니다. 살아있는 동물 이미징을 위한 이상적인 현미경 도구입니다. 그러나 다광자 및 기타 생체 내 현미경 기술은 심장 박동, 호흡, 연동 운동, 근육 긴장도 및 기타 생리적 기능으로 인한 조직 운동에 의해 제한되어 이미징 획득 및 분석을 방해합니다. 이러한 움직임은 시간적 및 공간적 해상도를 손상시키고 때로는 후속 분석을 방해하기도 하므로 정확한 데이터 분석 및 해석이 가능하도록 적절하게 해결해야 합니다. 조직 운동으로 인한 인공물을 낮추거나 방지하기 위한 몇 가지 전략이 개발되었습니다. 이 프로토콜은 VivoFollow9라는 현장 드리프트 보정 소프트웨어를 적용하여 이미지 획득 중 조직 드리프트를 교정합니다. 이 접근 방식은 필요한 이미지 안정화를 제공하여 장기 이미징 및 세포 추적 분석을 가능하게 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
백혈구 모집의 다광자 생체내 분석의 설명된 방법은 (면역-) 조직학적 또는 FACS 분석과 같은 백혈구 모집 연구에 일반적으로 사용되는 도구에 대한 추가를 나타냅니다. 이 이미징 방법을 사용하면 동맥 형성 동안 백혈구 부착 및 혈관외 유출의 동적 과정을 더 자세히 시각화할 수 있습니다10. 이 방법의 부가가치에도 불구하고 제공된 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계와 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB 914(HI-A/SM, 프로젝트 Z01)의 자금 지원을 받았습니다. 원고를 읽어주신 Susanne Stutte 박사님께 감사드립니다.
Materials
| 1.0 mL Syringe | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 309628 | syringe for injection |
| 3M Durapore Surgical Tape 1538-0 | 3M, St. Paul, MN, USA | 1538-0 | fixation tape |
| Atipamezole | Zoetis, Berlin, Germany | antagonize anesthesia | |
| Buprenorphine | Reckitt Benckiser Healthcare, Slough, UK | antagonize anesthesia | |
| C57/B6J mouse | Charles River, Sulzfeld, Germany | used animals for surgery/imaging | |
| CD41-FITC ab | Biolegend | 133904 | Platelet labeling in vivo |
| CD45-PE ab | Biolegend | 368510 | Leukocytes labelling in vivo |
| Disinfectant Cutasept | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland | AK64.2 | Disinfection |
| Eye cream (Bepanthen) | Bayer Vital GmbH | 5g | |
| Fentanyl | CuraMED Pharma, Karlsruhe, Germany | anesthesia | |
| Flumazenile | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland | antagonize anesthesia | |
| Fine bore polythene tubing | Smiths medical | Lot 278316 | 0.28 mm ID and 0.61 mm OD, tubing for the vein catheter |
| Histoacryl flexible | BRAUM | 1050052 | tissue glue |
| Imaris software | Oxford Instruments | version 9.2 | Used for cell tracking, cell speed analysis, 3D projection |
| Laser Doppler Imaging instrument | Moor LDI 5061 and Moor Software Version 3.01, Moor Instruments, Remagen, Germany | ||
| LEICA KL300 LED | Leica, Solms, Germany | light for microscope | |
| Leica M60 | Leica, Solms, Germany | microscope for surgery | |
| LEICA MC120 HD | Leica, Solms, Germany | camera for microscope | |
| Medetomidine | Pfizer Pharma, Berlin, Germany | anesthesia | |
| Midazolam | Ratiopharm GmbH, Ulm, Germany | anesthesia | |
| Multiphoton microscope | Lavision | TRIMScope II | WL 820 nm |
| NaCl 0.9% | Braun, Melsungen, Deutschland | 3570310 | saline for pocket |
| Naloxone | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland | antagonize anesthesia | |
| Needle 30 G | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 305128 | needle for i.v. catheter |
| Silk braided suture (0/7) | Pearsalls Ltd., Taunton, UK | SUT-S 103 | suture for femoral artery ligation |
| Ultrason Gel | SONOSID-ASID BONZ 250 mL | 782012 | gel for imaging |
| Vicryl 6.0 suture | Vicryl, Johnson&Johnson, New Brunswick, NJ, USA | NW-2347 | suture to build pocket |
| VivoFollow drift correction software | Developed by Mykhailo Vladymyrov | Reference 9 |
Riferimenti
- The top 10 causes of death. World Health Organization Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death (2020)
- Deindl, E., Schaper, W. The art of arteriogenesis. Cell Biochemistry and Biophysics. 43 (1), 1-15 (2005).
- Lasch, M., et al. Extracellular RNA released due to shear stress controls natural bypass growth by mediating mechanotransduction in mice. Blood. 134 (17), 1469-1479 (2019).
- Kumaraswami, K., et al. A simple and effective flow Ccytometry-based method for identification and quantification of tissue infiltrated leukocyte subpopulations in a mouse model of peripheral arterial disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (10), 3593 (2020).
- Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54166 (2016).
- Limbourg, A., et al. Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia. Nature Protocols. 4 (12), 1737 (2009).
- Wagner, M., et al. Intravital microscopy of monocyte homing and tumor-related angiogenesis in a murine model of peripheral arterial disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (126), e56290 (2017).
- Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. Advanced fluorescence microscopy techniques–FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).
- Vladymyrov, M., Abe, J., Moalli, F., Stein, J. V., Ariga, A. Real-time tissue offset correction system for intravital multiphoton microscopy. Journal of Immunological Methods. 438, 35-41 (2016).
- Chandraratne, S., et al. Critical role of platelet glycoprotein ibalpha in arterial remodeling. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (3), 589-597 (2015).
