Prøvepræparat og relativ kvantitet ved hjælp af reduktiv methylering af aminer til peptidomicsstudier
Summary
I denne artikel beskrives en prøveforberedelsesmetode baseret på varmeinaktivering for at bevare endogene peptider, så man undgår nedbrydning efter mortem, efterfulgt af relativ kvantitet ved hjælp af isotopmærkning plus LC-MS.
Abstract
Peptidomics kan defineres som den kvalitative og kvantitative analyse af peptider i en biologisk prøve. Dens vigtigste anvendelser omfatter identifikation af peptid biomarkører af sygdom eller miljøstress, identificere neuropeptider, hormoner, og bioaktive intracellulære peptider, opdage antimikrobielle og nutraceutical peptider fra protein hydrolysates, og kan bruges i undersøgelser til at forstå de proteolytiske processer. Den seneste fremskridt i prøve forberedelse, separation metoder, massespektrometri teknikker, og beregningsmæssige værktøjer relateret til protein sekventering har bidraget til stigningen i de identificerede peptider antal og peptidomer karakteriseret. Peptidomiske undersøgelser analyserer ofte peptider, der naturligt genereres i celler. Her beskrives en prøveforberedelsesprotokol baseret på varmeinaktivering, hvilket eliminerer proteaseaktivitet og ekstraktion med milde forhold, så der er ingen peptidbindingsspaltning. Derudover er den relative kvantitet af peptider ved hjælp af stabil isotopmærkning ved reduktiv methylering af aminer også vist. Denne mærkningsmetode har nogle fordele, da reagenserne er kommercielt tilgængelige, billige sammenlignet med andre, kemisk stabile, og tillader analyse af op til fem prøver i et enkelt LC-MS-løb.
Introduction
“Omics” videnskaber er karakteriseret ved den dybe analyse af et molekyle sæt, såsom DNA, RNA, proteiner, peptider, metabolitter, osv. Disse genererede store datasæt (genomforskning, transskriptomics, proteomics, peptidomics, metabolomics osv.) har revolutioneret biologien og ført til en avanceret forståelse af biologiske processer1. Udtrykket peptidomics begyndte at blive indført i begyndelsen af det 20. århundrede, og nogle forfattere har omtalt det som en gren af proteomics2. Peptidomics har imidlertid forskellige særegenheder, hvor hovedinteressen er at undersøge det naturligt genererede peptider indhold under cellulære processer, samt karakterisering af biologisk aktivitet af disse molekyler3,4.
Oprindeligt, bioaktiv peptid undersøgelser var begrænset til neuropeptider og hormon peptider gennem Edman nedbrydning og radioimmunoassay. Disse teknikker tillader imidlertid ikke en global analyse, afhængigt af isoleringen af hvert peptid i høje koncentrationer, tid til dannelse af antistoffer, udover krydsreaktivitetsmulighed5.
Peptidomics analyse blev først muliggjort efter flere fremskridt inden for flydende kromatografi koblet massespektrometri (LC-MS) og genom projekter, der leverede omfattende datapuljer for proteomics / peptidomics undersøgelser6,7. Desuden, en specifik peptid ekstraktion protokol for peptidomer skulle etableres, fordi de første undersøgelser, der analyserede neuropeptider globalt i hjerneprøver viste, at detektion blev påvirket af den massive nedbrydning af proteiner, som forekommer hovedsageligt i dette væv efter 1 min post-mortem. Tilstedeværelsen af disse peptidfragmenter maskeret neuropeptid signal og repræsenterede ikke peptidom in vivo. Dette problem blev løst hovedsageligt med anvendelsen af hurtig opvarmning inaktivering af proteaser ved hjælp af mikrobølge bestråling, som drastisk reduceret tilstedeværelsen af disse artefakt fragmenter og tillod ikke kun identifikation af neuropeptid fragmenter, men afslørede tilstedeværelsen af et sæt peptider fra cytosolic, mitokondrie, og nukleare proteiner, forskellige af nedbrydestom6,8,9.
Disse metodiske procedurer tillod en udvidelse af peptidomet ud over de velkendte neuropeptider, hvor hundredvis af intracellulære peptider, der hovedsagelig genereres af virkningen af proteaomer, er blevet identificeret i gær10, zebrafisk11, gnavervæv12 og menneskelige celler13. Snesevis af disse intracellulære peptider har i vid udstrækning vist sig at have både biologiske og farmakologiske aktiviteter14,15. Desuden kan disse peptider anvendes som sygdomsbiomarkører og muligvis have klinisk betydning, som det fremgår af cerebrospinalvæske fra patienter med intrakranielle saccular aneureursms16.
I øjeblikket, ud over identifikation af peptid sekvenser, er det muligt gennem massespektrometri at opnå data om absolut og relativ kvantitet. I den absolutte kvantitet sammenlignes peptidniveauerne i en biologisk prøve med syntetiske standarder, mens peptidniveauerne i den relative kvantitet sammenlignes mellem to eller flere prøver17. Relativ kvantitet kan udføres ved hjælp af følgende tilgange: 1) “label free”18; 2) in vivo metabolisk mærkning eller 3) kemisk mærkning. De sidste to er baseret på brugen af stabile isotopformer indarbejdet i peptider19,20. I etiketfri analyse estimeres peptidniveauerne ved at overveje signalstyrken (spektraltællinger) under LC-MS18. Men isotop mærkning kan opnå mere præcise relative niveauer af peptider.
Mange peptidomiske undersøgelser anvendes trimethylammonium butyrat (TMAB) mærkning reagenser som kemisk mærkning, og for nylig, Reduktiv methylering af aminer (RMA) med deuterated og ikke-deuterated former for formaldehyd og natrium cyanoborohydrid reagenser er blevet brugt11,21,22. TMAB-etiketterne er dog ikke kommercielt tilgængelige, og synteseprocessen er meget besværlig. På den anden side er reagenserne i RMA kommercielt tilgængelige, billige sammenlignet med andre etiketter, proceduren er enkel at udføre, og de mærkede peptider er stabile23,24.
Brugen af RMA indebærer dannelse af en Schiff base ved at tillade peptider til at reagere med formaldehyd, efterfulgt af en reduktion reaktion gennem cyanoborohydrid. Denne reaktion forårsager dimethylation af frie aminogrupper på N-terminaler og lysin sidekæder og monometyater N-terminal prolines. Hvordan proline rester er ofte sjældne på N-terminalen, næsten alle peptider med frie aminer på N-endestationen er mærket med to methylgrupper23,24,25.
Protocol
Representative Results
Discussion
I de fleste peptidomics undersøgelser er et af de kritiske trin uden tvivl prøvepræparatet, der skal udføres omhyggeligt for at undgå tilstedeværelsen af peptidfragmenter genereret af proteaser efter et par minutter efter mortem. De indledende undersøgelser af hjerneekstrakter fremstillet af ikke-mikrobølgede prøver viste, at et stort antal proteinfragmenter var til stede i 10-kDa-mikrofiltrene. Forskellige tilgange er blevet beskrevet for at undgå peptid spektre fra protein nedbrydning: fokuseret mikrobølge b…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Udviklingen og anvendelsen af de teknikker, der er beskrevet her, blev støttet af det brasilianske nationale forskningsråds tilskud 420811/2018-4 (LMC); Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (www.fapesp.br) giver tilskud 2019/16023-6 (LMC), 2019/17433-3 (LOF) og 21/01286-1 (MEME). Finansieringskilderne havde ingen rolle i undersøgelsen design, dataindsamling og analyse, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af artiklen.
Materials
| 10 kDa cut-off filters | Merck Millipore | UFC801024 | Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membrane, 10 kDa |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 1000291000 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 11213 | |
| analytical column (EASY-Column) | EASY-Column | (SC200) | 10 cm, ID75 µm, 3 µm, C18-A2 |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | MS-222 |
| Fluorescamine | Sigma-Aldrich | F9015 | |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| Formaldehyde-13C, d2, solution | Sigma-Aldrich | 596388 | |
| Formaldehyde-d2 solution | Sigma-Aldrich | 492620 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 33015 | |
| Fume hood | Quimis | Q216 | |
| Hydrochloric acid – HCl | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| LoBind-Protein retention tubes | Eppendorf | EP0030108116-100EA | |
| LTQ-Orbitrap Velos | Thermo Fisher Scientific | LTQ Velos | |
| Microwave oven | Panasonic | NN-ST67HSRU | |
| n Easy-nLC II nanoHPLC | Thermo Fisher Scientific | LC140 | |
| PEAKS Studio | Bioinformatics Solutions Inc. | VERSION 8.5 | |
| Phosphate-buffered saline | Invitrogen | 3002 | tablets |
| precolumn (EASY-Column) | Thermo Fisher Scientific | (SC001) | 2 cm, ID100 µm, 5 µm, C18-A1 |
| Refrigerated centrifuge | Hermle | Z326K | for conical tubes |
| Refrigerated centrifuge | Vision | VS15000CFNII | for microtubes |
| Reversed-phase cleanup columns (Oasis HLB 1 cc Cartridge) | Waters | 186000383 | Oasis HLB 1 cc Cartridge |
| Sodium cyanoborodeuteride – NaBD3CN | Sigma-Aldrich | 190020 | |
| Sodium cyanoborohydride – NaBH3CN | Sigma-Aldrich | 156159 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S9763 | NOTE: 0.2 M PB= 0.1 M phosphate buffer pH 6.8 (26.85 mL of Na2HPO3 1M) plus 0.1 M phosphate buffer pH 6.8 (23.15 mL of NaH2PO3 1M) to 250 ml of water |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S3139 | |
| Sonicator | Qsonica | Q55-110 | |
| Standard peptide | Proteimax | amino acid sequence: LTLRTKL | |
| Triethylammonium buffer – TEAB 1 M | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| Trifluoroacetic acid – TFA | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| Ultra purified water | Milli-Q | Direct-Q 3UV | |
| Vacuum centrifuge | GeneVac | MiVac DNA concentrator | |
| Water bath | Cientec | 266 | |
| Xcalibur Software | ThermoFisher Scientific | OPTON-30965 |
Riferimenti
- Kandpal, R., Saviola, B., Felton, J. The era of ‘omics unlimited. Biotechniques. 46 (5), 354-355 (2009).
- Farrokhi, N., Whitelegge, J. P., Brusslan, J. A. Plant peptides and peptidomics. Plant Biotechnology Journal. 6 (2), 105-134 (2008).
- Schulz-Knappe, P., Schrader, M., Zucht, H. D. The peptidomics concept. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 8 (8), 697-704 (2005).
- Dallas, D. C., et al. Current peptidomics: applications, purification, identification, quantification, and functional analysis. Proteomics. 15 (5-6), 1026-1038 (2015).
- Chard, T. An introduction to radioimmunoassay and related techniques (3rd Ed). FEBS Letters. 238 (1), 223 (1988).
- Svensson, M., Sköld, K., Svenningsson, P., Andren, P. E. Peptidomics-based discovery of novel neuropeptides. Journal of Proteome Research. 2 (2), 213-219 (2003).
- Baggerman, G., et al. Peptidomics. Journal of Chromatography B. 803, 3-16 (2004).
- Theodorsson, E., Stenfors, C., Mathe, A. A. Microwave irradiation increases recovery of neuropeptides from brain tissues. Peptides. 11, 1191-1197 (1990).
- Che, F. Y., Lim, J., Pan, H., Biswas, R., Fricker, L. D. Quantitative neuropeptidomics of microwave-irradiated mouse brain and pituitary. Molecular & Cellular Proteomics. 4, 1391-1405 (2005).
- Dasgupta, S., et al. Analysis of the yeast peptidome and comparison with the human peptidome. PLoS One. 11 (9), 0163312 (2016).
- Teixeira, C. M. M., Correa, C. N., Iwai, L. K., Ferro, E. S., Castro, L. M. Characterization of Intracellular Peptides from Zebrafish (Danio rerio) Brain. Zebrafish. 16 (3), 240-251 (2019).
- Fricker, L. D. Analysis of mouse brain peptides using mass spectrometry-based peptidomics: implications for novel functions ranging from non-classical neuropeptides to microproteins. Molecular BioSystems. 6 (8), 1355-1365 (2010).
- Gelman, J. S., Sironi, J., Castro, L. M., Ferro, E. S., Fricker, L. D. Peptidomic analysis of human cell lines. Journal of Proteome Research. 10 (4), 1583-1592 (2011).
- De Araujo, C. B., et al. Intracellular peptides in cell biology and pharmacology. Biomolecules. 9, 150 (2019).
- Gewehr, M. C. F., Silverio, R., Rosa-Neto, J. C., Lira, F. S., Reckziegel, P., Ferro, E. S. Peptides from natural or rationally designed sources can be used in overweight, obesity, and type 2 diabetes therapies. Molecules. 25 (5), 1093 (2020).
- Sakaya, G. R., et al. Peptidomic profiling of cerebrospinal fluid from patients with intracranial saccular aneurysms. Journal of Proteomics. 240 (3), 104188 (2021).
- Fricker, L. Quantitative peptidomics: General considerations. Methods in Molecular Biology. 1719, 121-140 (2018).
- Southey, B. R., et al. Comparing label-free quantitative peptidomics approaches to characterize diurnal variation of peptides in the rat suprachiasmatic nucleus. Analytical Chemistry. 86 (1), 443-452 (2014).
- Chen, X., Wei, S., Ji, Y., Guo, X., Yang, F. Quantitative proteomics using SILAC: Principles, applications, and developments. Proteomics. 15 (18), 3175-3192 (2015).
- Boonen, K., et al. Quantitative peptidomics with isotopic and isobaric tags. Methods in Molecular Biology. 1719, 141-159 (2018).
- Gewehr, M. C. F., et al. The relevance of thimet oligopeptidase in the regulation of energy metabolism and diet-induced obesity. Biomolecules. 10 (2), 321 (2020).
- Fiametti, L. O., Correa, C. N., Castro, L. M. Peptide profile of zebrafish brain in a 6-OHDA-induced Parkinson model. Zebrafish. 18 (1), 55-65 (2021).
- Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).
- Dasgupta, S., Castro, L. M., Tashima, A. K., Fricker, L. Quantitative peptidomics using reductive methylation of amines. Methods in Molecular Biology. 1719, 161-174 (2018).
- Tashima, A. K., Fricker, L. D. Quantitative peptidomics with five-plex reductive methylation labels. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (5), 866-878 (2018).
- Che, F. Y., et al. Optimization of neuropeptide extraction from the mouse hypothalamus. Journal of Proteome Research. 6 (12), 4667-4676 (2007).
- Lyons, P. J., Fricker, L. D. Peptidomic approaches to study proteolytic activity. Current Protocols in Protein Science. , 13 (2011).
- Udenfriend, S., et al. Fluorescamine: a reagent for assay of amino acids, peptides, proteins, and primary amines in the picomole range. Science. 178 (4063), 871-872 (1972).
- Ma, B., et al. PEAKS: powerful software for peptide de novo sequencing by tandem mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 17 (20), 2337-2342 (2003).
- Zhang, J., et al. PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (4), 1-8 (2012).
- Sturm, R. M., Dowell, J. A., Li, L. Rat brain neuropeptidomics: tissue collection, protease inhibition, neuropeptide extraction, and mass spectrometric analysis. Methods in Molecular Biology. 615, 217-226 (2010).
- Fricker, L. D. Limitations of mass spectrometry-based peptidomic approaches. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (12), 1981-1991 (2015).
- Ross, , et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Molecular & Cellular Proteomics. 3, 1154-1169 (2004).
- Thompson, A., et al. Tandem mass tags: a novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75, 1895-1904 (2003).
