Monstervoorbereiding en relatieve kwantificering met behulp van reductieve methylering van amines voor peptidomics-studies
Summary
Dit artikel beschrijft een monstervoorbereidingsmethode op basis van warmte-inactivatie om endogene peptiden te behouden die post-mortem degradatie voorkomen, gevolgd door relatieve kwantificering met behulp van isotopische etikettering plus LC-MS.
Abstract
Peptidomics kan worden gedefinieerd als de kwalitatieve en kwantitatieve analyse van peptiden in een biologisch monster. De belangrijkste toepassingen omvatten het identificeren van de peptide biomarkers van ziekte of omgevingsstress, het identificeren van neuropeptiden, hormonen en bioactieve intracellulaire peptiden, het ontdekken van antimicrobiële en nutraceutische peptiden uit eiwithydrolysaten, en kunnen worden gebruikt in studies om de proteolytische processen te begrijpen. De recente vooruitgang in monstervoorbereiding, scheidingsmethoden, massaspectrometrietechnieken en computationele hulpmiddelen met betrekking tot eiwitsequencing heeft bijgedragen aan de toename van het geïdentificeerde aantal peptiden en peptidomes gekarakteriseerd. Peptidomic studies analyseren vaak peptiden die van nature in cellen worden gegenereerd. Hier wordt een monstervoorbereidingsprotocol op basis van warmte-inactivatie beschreven, dat protease-activiteit en extractie met milde omstandigheden elimineert, zodat er geen splitsing van peptidebindingen is. Daarnaast wordt ook de relatieve kwantificering van peptiden met behulp van stabiele isotoopetikettering door reductieve methylering van amines getoond. Deze etiketteringsmethode heeft enkele voordelen omdat de reagentia in de handel verkrijgbaar zijn, goedkoop in vergelijking met andere, chemisch stabiel en de analyse van maximaal vijf monsters in een enkele LC-MS-run mogelijk maken.
Introduction
“Omics” wetenschappen worden gekenmerkt door de diepe analyse van een molecuulset, zoals DNA, RNA, eiwitten, peptiden, metabolieten, enz. Deze gegenereerde grootschalige datasets (genomics, transcriptomics, proteomics, peptidomics, metabolomics, etc.) hebben een revolutie teweeggebracht in de biologie en geleid tot een geavanceerd begrip van biologische processen1. De term peptidomics begon te worden geïntroduceerd in het begin van de 20e eeuw, en sommige auteurs hebben ernaar verwezen als een tak van proteomics2. Peptidomics heeft echter verschillende bijzonderheden, waarbij het belangrijkste belang is om het natuurlijk gegenereerde peptidengehalte tijdens cellulaire processen te onderzoeken, evenals de karakterisering van biologische activiteit van deze moleculen3,4.
Aanvankelijk waren bioactieve peptidestudies beperkt tot de neuropeptiden en hormoonpeptiden door Edman-afbraak en radioimmunoassay. Deze technieken laten echter geen globale analyse toe, afhankelijk van de isolatie van elk peptide in hoge concentraties, tijd voor het genereren van antilichamen, naast kruisreactiviteitsmogelijkheid5.
Peptidomics-analyse werd pas mogelijk gemaakt na verschillende ontwikkelingen in vloeistofchromatografie gekoppelde massaspectrometrie (LC-MS) en genoomprojecten die uitgebreide datapools opleverden voor proteomics/peptidomics studies6,7. Bovendien moest een specifiek peptide-extractieprotocol voor peptidomes worden vastgesteld omdat de eerste studies die neuropeptiden wereldwijd in hersenmonsters analyseerden, aantoonden dat detectie werd beïnvloed door de massale afbraak van eiwitten, die voornamelijk in dit weefsel voorkomen na 1 minuut post-mortem. De aanwezigheid van deze peptidefragmenten maskeerde het neuropeptidesignaal en vertegenwoordigde niet de peptidome in vivo. Dit probleem werd voornamelijk opgelost met de toepassing van snelle verwarmingsinactivatie van proteasen met behulp van microgolfbestraling, die de aanwezigheid van deze artefactfragmenten drastisch verminderde en niet alleen de identificatie van neuropeptidefragmenten mogelijk maakte, maar ook de aanwezigheid van een reeks peptiden uit cytosolische, mitochondriale en nucleaire eiwitten onthulde, verschillend van degradome6,8,9.
Deze methodologische procedures maakten een uitbreiding van de peptidome mogelijk voorbij de bekende neuropeptiden, waar honderden intracellulaire peptiden die voornamelijk worden gegenereerd door de werking van proteasooms zijn geïdentificeerd in gist10, zebravis11, knaagdierweefsels12 en menselijke cellen13. Van tientallen van deze intracellulaire peptiden is uitgebreid aangetoond dat ze zowel biologische als farmacologische activiteiten hebben14,15. Bovendien kunnen deze peptiden worden gebruikt als ziektebiomarkers en hebben ze mogelijk klinische betekenis, zoals aangetoond in hersenvocht van patiënten met intracraniale sacculaire aneurysmata16.
Momenteel is het, naast de identificatie van peptidesequenties, mogelijk om door massaspectrometrie gegevens van absolute en relatieve kwantificering te verkrijgen. In de absolute kwantificering worden de peptideniveaus in een biologisch monster vergeleken met synthetische standaarden, terwijl in de relatieve kwantificering de peptideniveaus worden vergeleken tussen twee of meer monsters17. Relatieve kwantificering kan worden uitgevoerd met behulp van de volgende benaderingen: 1) “labelvrij”18; 2) in vivo metabole etikettering of 3) chemische etikettering. De laatste twee zijn gebaseerd op het gebruik van stabiele isotopische vormen die zijn opgenomen in peptiden19,20. In labelvrije analyse worden de peptideniveaus geschat door rekening te houden met de signaalsterkte (spectrale tellingen) tijdens de LC-MS18. Isotopische etikettering kan echter nauwkeurigere relatieve niveaus van peptiden verkrijgen.
Veel peptidomische studies gebruikten trimethylammoniumbutyraat (TMAB) etiketteringsreagentia als chemische etikettering, en meer recent zijn reductieve methylatie van amines (RMA) met gedeutereerde en niet-gedeutereerde vormen van formaldehyde en natriumcyanoborohydridereagentia gebruikt11,21,22. De TMAB-labels zijn echter niet commercieel verkrijgbaar en het syntheseproces is zeer arbeidsintensief. Aan de andere kant zijn de reagentia in de RMA commercieel verkrijgbaar, goedkoop in vergelijking met andere labels, is de procedure eenvoudig uit te voeren en zijn de gelabelde peptiden stabiel23,24.
Het gebruik van RMA omvat het vormen van een Schiff-base door de peptiden te laten reageren met formaldehyde, gevolgd door een reductiereactie via het cyanoborohydride. Deze reactie veroorzaakt dimethylering van vrije aminogroepen op N-terminals en lysine zijketens en monomethylaten N-terminale prolines. Hoe prolineresiduen vaak zeldzaam zijn op de N-terminal, vrijwel alle peptiden met vrije amines op de N-terminus zijn gelabeld met twee methylgroepen23,24,25.
Protocol
Representative Results
Discussion
In de meeste peptidomics-studies is een van de kritieke stappen zonder twijfel de monstervoorbereiding die zorgvuldig moet worden uitgevoerd om de aanwezigheid van peptidefragmenten gegenereerd door proteasen na een paar minuten post-mortem te voorkomen. De eerste studies op hersenextracten bereid uit niet-microgolfmonsters toonden een groot aantal eiwitfragmenten aan die aanwezig waren in de 10-kDa-microfiltraten. Er zijn verschillende benaderingen beschreven om peptidespectra van eiwitafbraak te voorkomen: gerichte <su…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De ontwikkeling en het gebruik van de hier beschreven technieken werden ondersteund door de Braziliaanse National Research Council subsidie 420811/2018-4 (LMC); Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (www.fapesp.br) subsidies 2019/16023-6 (LMC), 2019/17433-3 (LOF) en 21/01286-1 (MEME). De financiers hadden geen rol in de studieopzet, gegevensverzameling en -analyse, beslissing om te publiceren of voorbereiding van het artikel.
Materials
| 10 kDa cut-off filters | Merck Millipore | UFC801024 | Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membrane, 10 kDa |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 1000291000 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 11213 | |
| analytical column (EASY-Column) | EASY-Column | (SC200) | 10 cm, ID75 µm, 3 µm, C18-A2 |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | MS-222 |
| Fluorescamine | Sigma-Aldrich | F9015 | |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| Formaldehyde-13C, d2, solution | Sigma-Aldrich | 596388 | |
| Formaldehyde-d2 solution | Sigma-Aldrich | 492620 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 33015 | |
| Fume hood | Quimis | Q216 | |
| Hydrochloric acid – HCl | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| LoBind-Protein retention tubes | Eppendorf | EP0030108116-100EA | |
| LTQ-Orbitrap Velos | Thermo Fisher Scientific | LTQ Velos | |
| Microwave oven | Panasonic | NN-ST67HSRU | |
| n Easy-nLC II nanoHPLC | Thermo Fisher Scientific | LC140 | |
| PEAKS Studio | Bioinformatics Solutions Inc. | VERSION 8.5 | |
| Phosphate-buffered saline | Invitrogen | 3002 | tablets |
| precolumn (EASY-Column) | Thermo Fisher Scientific | (SC001) | 2 cm, ID100 µm, 5 µm, C18-A1 |
| Refrigerated centrifuge | Hermle | Z326K | for conical tubes |
| Refrigerated centrifuge | Vision | VS15000CFNII | for microtubes |
| Reversed-phase cleanup columns (Oasis HLB 1 cc Cartridge) | Waters | 186000383 | Oasis HLB 1 cc Cartridge |
| Sodium cyanoborodeuteride – NaBD3CN | Sigma-Aldrich | 190020 | |
| Sodium cyanoborohydride – NaBH3CN | Sigma-Aldrich | 156159 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S9763 | NOTE: 0.2 M PB= 0.1 M phosphate buffer pH 6.8 (26.85 mL of Na2HPO3 1M) plus 0.1 M phosphate buffer pH 6.8 (23.15 mL of NaH2PO3 1M) to 250 ml of water |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S3139 | |
| Sonicator | Qsonica | Q55-110 | |
| Standard peptide | Proteimax | amino acid sequence: LTLRTKL | |
| Triethylammonium buffer – TEAB 1 M | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| Trifluoroacetic acid – TFA | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| Ultra purified water | Milli-Q | Direct-Q 3UV | |
| Vacuum centrifuge | GeneVac | MiVac DNA concentrator | |
| Water bath | Cientec | 266 | |
| Xcalibur Software | ThermoFisher Scientific | OPTON-30965 |
Riferimenti
- Kandpal, R., Saviola, B., Felton, J. The era of ‘omics unlimited. Biotechniques. 46 (5), 354-355 (2009).
- Farrokhi, N., Whitelegge, J. P., Brusslan, J. A. Plant peptides and peptidomics. Plant Biotechnology Journal. 6 (2), 105-134 (2008).
- Schulz-Knappe, P., Schrader, M., Zucht, H. D. The peptidomics concept. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 8 (8), 697-704 (2005).
- Dallas, D. C., et al. Current peptidomics: applications, purification, identification, quantification, and functional analysis. Proteomics. 15 (5-6), 1026-1038 (2015).
- Chard, T. An introduction to radioimmunoassay and related techniques (3rd Ed). FEBS Letters. 238 (1), 223 (1988).
- Svensson, M., Sköld, K., Svenningsson, P., Andren, P. E. Peptidomics-based discovery of novel neuropeptides. Journal of Proteome Research. 2 (2), 213-219 (2003).
- Baggerman, G., et al. Peptidomics. Journal of Chromatography B. 803, 3-16 (2004).
- Theodorsson, E., Stenfors, C., Mathe, A. A. Microwave irradiation increases recovery of neuropeptides from brain tissues. Peptides. 11, 1191-1197 (1990).
- Che, F. Y., Lim, J., Pan, H., Biswas, R., Fricker, L. D. Quantitative neuropeptidomics of microwave-irradiated mouse brain and pituitary. Molecular & Cellular Proteomics. 4, 1391-1405 (2005).
- Dasgupta, S., et al. Analysis of the yeast peptidome and comparison with the human peptidome. PLoS One. 11 (9), 0163312 (2016).
- Teixeira, C. M. M., Correa, C. N., Iwai, L. K., Ferro, E. S., Castro, L. M. Characterization of Intracellular Peptides from Zebrafish (Danio rerio) Brain. Zebrafish. 16 (3), 240-251 (2019).
- Fricker, L. D. Analysis of mouse brain peptides using mass spectrometry-based peptidomics: implications for novel functions ranging from non-classical neuropeptides to microproteins. Molecular BioSystems. 6 (8), 1355-1365 (2010).
- Gelman, J. S., Sironi, J., Castro, L. M., Ferro, E. S., Fricker, L. D. Peptidomic analysis of human cell lines. Journal of Proteome Research. 10 (4), 1583-1592 (2011).
- De Araujo, C. B., et al. Intracellular peptides in cell biology and pharmacology. Biomolecules. 9, 150 (2019).
- Gewehr, M. C. F., Silverio, R., Rosa-Neto, J. C., Lira, F. S., Reckziegel, P., Ferro, E. S. Peptides from natural or rationally designed sources can be used in overweight, obesity, and type 2 diabetes therapies. Molecules. 25 (5), 1093 (2020).
- Sakaya, G. R., et al. Peptidomic profiling of cerebrospinal fluid from patients with intracranial saccular aneurysms. Journal of Proteomics. 240 (3), 104188 (2021).
- Fricker, L. Quantitative peptidomics: General considerations. Methods in Molecular Biology. 1719, 121-140 (2018).
- Southey, B. R., et al. Comparing label-free quantitative peptidomics approaches to characterize diurnal variation of peptides in the rat suprachiasmatic nucleus. Analytical Chemistry. 86 (1), 443-452 (2014).
- Chen, X., Wei, S., Ji, Y., Guo, X., Yang, F. Quantitative proteomics using SILAC: Principles, applications, and developments. Proteomics. 15 (18), 3175-3192 (2015).
- Boonen, K., et al. Quantitative peptidomics with isotopic and isobaric tags. Methods in Molecular Biology. 1719, 141-159 (2018).
- Gewehr, M. C. F., et al. The relevance of thimet oligopeptidase in the regulation of energy metabolism and diet-induced obesity. Biomolecules. 10 (2), 321 (2020).
- Fiametti, L. O., Correa, C. N., Castro, L. M. Peptide profile of zebrafish brain in a 6-OHDA-induced Parkinson model. Zebrafish. 18 (1), 55-65 (2021).
- Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).
- Dasgupta, S., Castro, L. M., Tashima, A. K., Fricker, L. Quantitative peptidomics using reductive methylation of amines. Methods in Molecular Biology. 1719, 161-174 (2018).
- Tashima, A. K., Fricker, L. D. Quantitative peptidomics with five-plex reductive methylation labels. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (5), 866-878 (2018).
- Che, F. Y., et al. Optimization of neuropeptide extraction from the mouse hypothalamus. Journal of Proteome Research. 6 (12), 4667-4676 (2007).
- Lyons, P. J., Fricker, L. D. Peptidomic approaches to study proteolytic activity. Current Protocols in Protein Science. , 13 (2011).
- Udenfriend, S., et al. Fluorescamine: a reagent for assay of amino acids, peptides, proteins, and primary amines in the picomole range. Science. 178 (4063), 871-872 (1972).
- Ma, B., et al. PEAKS: powerful software for peptide de novo sequencing by tandem mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 17 (20), 2337-2342 (2003).
- Zhang, J., et al. PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (4), 1-8 (2012).
- Sturm, R. M., Dowell, J. A., Li, L. Rat brain neuropeptidomics: tissue collection, protease inhibition, neuropeptide extraction, and mass spectrometric analysis. Methods in Molecular Biology. 615, 217-226 (2010).
- Fricker, L. D. Limitations of mass spectrometry-based peptidomic approaches. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (12), 1981-1991 (2015).
- Ross, , et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Molecular & Cellular Proteomics. 3, 1154-1169 (2004).
- Thompson, A., et al. Tandem mass tags: a novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75, 1895-1904 (2003).
