אימונופלואורסצנציה של השחלה כולה, ניקוי ומיקרוסקופיה מרובת פוטון לניתוח תלת-ממדי כמותי של עתודת השחלות המתפתחות בעכבר
Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול מותאם להדמיית שחלות שלמות לניתוחים כמותיים ואיכותיים באמצעות שמירה חיסונית בהרכבה מלאה, מיקרוסקופיית מולטי-פוטון והדמיה וניתוח תלת-ממדיים. פרוטוקול זה מתאים לעיבוד בעל תפוקה גבוהה, אמין וניתן לחזרה, החל על טוקסיקולוגיה, אבחון קליני ובדיקות גנומיות של תפקוד השחלות.
Abstract
פוריות הנקבה ותוחלת חיי הרבייה תלויים באיכות ובכמות של עתודת הביציות השחלתית. על פי הערכות, כ-80% מתאי הנבט הנקביים הנכנסים לפרופאזה מיוטית אני מסולקים במהלך התשה של ביציות עובריות (FOA) ובשבוע הראשון לחיים שלאחר הלידה. שלושה מנגנונים עיקריים מווסתים את מספר הביציות ששורדות במהלך ההתפתחות ומבססות את עתודת השחלות אצל נקבות הנכנסות לגיל ההתבגרות. בגל הראשון של אובדן ביציות, 30-50% מהביציות מסולקות במהלך FOA מוקדם, תופעה המיוחסת לביטוי גבוה של יסוד גרעיני משולב ארוך-1 (LINE-1). הגל השני של אובדן ביציות הוא חיסול ביציות עם פגמים מיוטיים על ידי מחסום איכות מיוטי. הגל השלישי של אובדן ביציות מתרחש באופן פרינטלי במהלך היווצרות זקיקים קדמוניים כאשר חלק מהביציות אינן מצליחות ליצור זקיקים. עדיין לא ברור מה מווסת כל אחד משלושת הגלים האלה של אובדן ביציות וכיצד הם מעצבים את שמורת השחלות בעכברים או בבני אדם.
אימונופלואורסצנציה והדמיה תלת-ממדית פתחו אפיק חדש לדימוי ולניתוח התפתחות הביציות בהקשר של השחלה כולה ולא בקטעים דו-ממדיים פחות אינפורמטיביים. מאמר זה מספק פרוטוקול מקיף לחיסון שחלות שלם וסליקה אופטית, המניב הכנות להדמיה באמצעות מיקרוסקופיית מולטיפוטונים ומידול תלת-ממדי באמצעות תוכנה זמינה מסחרית. הוא מראה כיצד ניתן להשתמש בשיטה זו כדי להראות את הדינמיקה של התשה של ביציות במהלך התפתחות השחלות בעכברי C57BL/6J ולכמת את אובדן הביציות במהלך שלושת הגלים של חיסול הביציות. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על שחלות טרום לידתיות ומוקדם לאחר הלידה עבור הדמיה וכימות של ביציות, כמו גם גישות כמותיות אחרות. חשוב לציין שהפרוטוקול פותח באופן אסטרטגי כדי להתאים לעיבוד בעל תפוקה גבוהה, אמין וניתן לחזרה שיכול לענות על הצרכים בטוקסיקולוגיה, אבחון קליני ובדיקות גנומיות של תפקוד השחלות.
Introduction
רוב נקבות היונקים נולדות עם מספר סופי של ביציות שנעצרו במיוטיות המאוחסנות בתוך זקיקים ראשוניים, המהוות את שמורת השחלות (OR)1,2. ה- OR קובע את תוחלת החיים הכוללת של הרבייה הנשית ואתבריאותה 3. ה-OR בדרך כלל יורד בגודלו עם ההזדקנות וניתן לרוקן אותו בטרם עת עם חשיפה לחומרים גנוטוקסיים מסוימים (הקרנות/כימותרפיה) ולחצים סביבתיים (תת-תזונה), מה שמוביל לאי פוריות 4,5,6. לעתים קרובות ניתן לייחס אי פוריות נשית אידיופטית לאיכות הגנטית והפיזיולוגית של ביציות המתפתחות מה-OR ונשארות לא מובנות היטב 7,8. מכיוון שהקדשת זקיק נקבה נקבעת במידה רבה מראש על ידי לידה, חיוני להבין את מנגנוני הרגולציה המעורבים בהקמה ובתחזוקה של OR.
בעכברים, היווצרות OR מתחילה במפרט של תאי נבט ראשוניים (PGCs) סביב היום העוברי (E) 7.52. המחשבים נודדים לרכסי איברי המין, שם הם ישכנו על ידי כ- E10.59. ההתרבות הנרחבת הבאה מתרחשת עם ציטוקינזיזה לא שלמה וכתוצאה מכך נוצרות ציסטות שיתפרקו בהמשך ההתפתחות10,11. בסביבות E12.5, נקבע מין גונדלי, והתפשטות PGC נעצרת בשחלות. אצל נקבות, מחשבים אישיים, כיום ביציות, נכנסים לפרופאזה מיוטית I (MPI) בסביבות E13.512,13. ביציות מתקדמות דרך MPI ממושך ונעצרות בשלב ההכתבה סביב זמן הלידה. במהלך השבוע הראשון לאחר הלידה, כל ביצית שנעצרה מוקפת בתאי גרנולוזה, ובכך יוצרת זקיק קדמוני.
מספר הזקיקים הבראשיתיים ב-OR של נקבה תלוי בכמה ביציות שרדו את גלי סילוק הביציות המתרחשים לפני ובמהלך מעצר MPI באמצעות אפופטוזיס, אוטופגיה או נמק14,15. הגל הראשון מתרחש במהלך התפתחות העובר וידוע בשם FOA. FOA הוא תהליך שמור מבחינה אבולוציונית אצל נקבות (יונקים ולא יונקים), לפיו כ-50-80% מהביציות מסולקות בהתאם למין הנקבה 16,17,18,19. בעכברים, FOA מתרחש במהלך E15.5 עד E18.5 ויוחס להפעלה מחדש ולביטוי של רצפי LINE-1 רטרו-טרנספוזונים הגורמים למוות של ביציות20,21. הגל השני של חיסול ביציות מתרחש דרך מחסום מיוטי שמחסל ביציות עם פגמים מיוטיים כמו שברים דו-גדיליים של דנ”א שלא תוקן (DSBs)22,23. הגל הבא של חיסול ביציות מתרחש במהלך התמוטטות ציסטה, ומגיע לשיאו במהלך היווצרות של זקיקים ראשוניים, שכל אחד מהם מכיל ביצית אחת 10,11,24,25.
בעכברים, עתודת הזקיקים הבראשיתית הוקמה במידה רבה על ידי גיל ההתבגרות, ולאחר מכן היא פוחתת כאשר זקיקים ראשוניים מופעלים לצמיחה במהלך מחזורי רבייה רגילים. גודל OR משתנה בין נשים בודדות ובין זנים גנטיים שונים של עכברים; עם זאת, הוויסות הגנטי של גודל OR אינו מובן היטב 26,27,28,29. מחקרים גנטיים של ויסות OR נפגעים על ידי היעדר פרוטוקולים סטנדרטיים לחקור את גלי חיסול הביציות במהלך התפתחות טרום לידתית ואחרי לידה. מספר מתודולוגיות לכימות ביציות פותחו בעכברים, כאשר הנפוצה והנפוצה ביותר היא הערכה היסטומורפיתמטרית של חלקים היסטולוגיים30,31. בטכניקה זו, ביציות מזוהות בקטעים סדרתיים עם כתמים היסטולוגיים, כגון המטוקסילין ואוזין (H&E) וחומצה מחזורית-שיף (PAS) או סמנים פלואורסצנטיים. טכניקה זו אמינה אם כל התנאים נשארים קבועים, כולל עובי חתך, התאוששות יעילה של כל החלקים לאורך השחלה, ואת תוכניות הספירה של מעבדות בודדות. עם זאת, המספרים המדווחים על ידי מעבדות שונות לעתים קרובות שונים באופן משמעותי ולכן אינם ניתנים להשוואה בקלות.
יתר על כן, בהינתן הבדלים גנטיים, השימוש בזני עכברים שונים יכול גם להשפיע על ספירת הביציות. גישות חישוביות נוספות פותחו להערכה היסטומורפיתמטרית וכוללות זיהוי אוטומטי של ביציות באמצעות גישת השבר, ספירה אוטומטית באמצעות אלגוריתמים חישוביים ושחזור תלת-ממדי של תמונות היסטולוגיות כדי למנוע ספירות מרובות של אותה ביציה 31,32,33,34,35,36 . גם כאשר שיפורים אלה מתווספים להערכה היסטומומורפומטרית, הטכניקה היא יחסית עתירת עבודה, במיוחד עבור מחקרים בקנה מידה גדול ותפוקה גבוהה. ייתכן שהנתונים שנאספו לא יהיו ניתנים לשחזור ולהשוואה בין מחקרים בשל הבדלים בסכמות הספירה, באלגוריתמים הממוחשבים ובתוכנות שבהן נעשה שימוש.
לאחרונה, מואצת על ידי פיתוח של מיקרוסקופיית מולטיפוטונים ויריעות אור חדשות ברזולוציה בינונית ושיטות ניקוי רקמות אופטיות, טכניקות מידול וניתוח תלת-ממדיות לשחלות שלמות הופכות לשיטה המועדפת לכימות יעיל של מספרי ביציות וחקר לוקליזציה ודינמיקה של חלבונים37,38. שיטות תלת-ממדיות אלה הן בדרך כלל יתרון בהשוואה לשיטות היסטולוגיות, שכן רקמות ואיברים נשמרים טוב יותר ונשמרים ללא פגע. יתר על כן, ניתוח ומידול תלת-ממדיים מספקים תובנות נוספות לגבי תפקוד ואינטראקציות בתוך ובין נישות תאים או תת-מבנים בתוך האיבר שעלולים להחמיץ בניתוח דו-ממדי.
ניתוח תלת-ממדי של איברים שלמים דורש אופטימיזציה של קיבוע, חיסון ופרוטוקולי ניקוי אופטיים עבור איברים בודדים, כגון שחלות, ללא עיוות או נזק לרקמות. אופטימיזציה נוספת של הרכבה לדוגמה להדמיה נדרשת למיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה ועשויה להיות תלויה בפלטפורמת ההדמיה הזמינה. לבסוף, הדמיה של השחלה השלמה כולה מייצרת כמות גדולה של נתונים עבור ניתוחים חישוביים מאוחרים יותר. לכן, יש צורך לפתח שיטות תלת-ממדיות סטנדרטיות לספירת ביציות למחקרים השוואתיים ולשלבים התפתחותיים שונים.
פרוטוקול זה משתמש בפרוטוקולי סילוק חיסוני סטנדרטיים ודווחו בעבר, תוך התמקדות בגישה פשוטה, ידידותית למשתמש ותפוקה גבוהה 38,39,40,41. הפרוטוקול מותאם לניתוח מספר גדול של שחלות טרום לידתיות ואחרי לידה עד ליום 28 שלאחר הלידה (P28) וגדלים משתנים של שחלות מרקע גנטי שונה של עכברים. הצעדים החיסוניים דומים לכל השלבים; עם זאת, פרוטוקולי הסליקה שונים עבור שחלות ההתבגרות בשל גודלן הגדול יותר, ScaleS4(0) ו- CUBIC עבור שחלות קטנות וגדולות, בהתאמה40,41. יתר על כן, זלוף של כל הגוף מבוצע בעכברי P28 לפני הקיבוע כדי למנוע אוטופלואורסצנציה מתאי הדם. מיקרוסקופ מולטי-פוטון נבנה על פלטפורמת Leica DIVE/4Tune כחלופה למיקרוסקופ יריעות אור כדי להשיג תמונות, ותוכנת ההדמיה והניתוח התלת-ממדית של IMARIS עם כלים אנליטיים שונים נבחרה לפרוטוקול זה. פרוטוקול זה פשוט למעקב ופחות מעשי, ומכאן חיסכון בזמן. יתר על כן, כימות הביציות הוא מהיר יחסית, בהתאם לגודל השחלה וסידור הביציות.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה מציג פרוטוקול חיסון והדמיה תלת-ממדי מפורט לשחלות טרום לידתיות ואחרי לידתיות למחקרים בתפוקה גבוהה והשוואתיות לכימות תאי נבט ולוקליזציה של חלבונים. פיתחנו את הפרוטוקול הזה כדי לנתח את מספרי הביציות בשחלות (N=6-12) בשש נקודות זמן התפתחותיות ב-10-16 זנים שונים, כאשר 2-4 לוחות 24-well מעובדים בד?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי המכונים הלאומיים לבריאות (R01 HD093778 ל- E.B-F ו- T32 HD007065 ל- R.B). אנו מודים לזאכרי בוצ’ר על עזרתו בניסוי הקרינה. אנו מודים למרי אן הנדל על הקריאה הביקורתית בכתב היד. אנו מודים תודה על תרומתם של סוניה ארטופוזה ושירות הליבה של המיקרוסקופיה במעבדת ג’קסון על סיוע מומחה בעבודת המיקרוסקופיה המתוארת בפרסום זה וג’ארק טרפסו משירותי המכשירים המדעיים במעבדת ג’קסון לתכנון שקופית המתאם המודפסת בתלת-ממד.
Materials
| Benchtop Incubator | Benchmark Scientific | H2200-H | 37 °C incubator |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 000664 | mouse inbred strain |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D1435 | Hazardous material |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S6021 | |
| Dumont #5 Forceps | FST | 91150-20 | |
| FastWells Reagent Barriers | GraceBio | 664113 | Sticky and flexible silicone gasket (adhesive well) |
| Fine Scissors | FST | 91460-11 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G2025 | |
| Glycine | ThermoFisher Scientific | BP381-500 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21246 | Dilution 1:1000 |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-21434 | Dilution 1:1000 |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| IMARIS Software | Oxford Instruments | Version 9.7.0 | Image visualization and analysis software |
| Insight X3 | Spectra-Physics | InSight X3 Tunable Ultrafast Laser | Laser for Multiphoton Imaging |
| LASX software | Leica | Version 3.5.6 | Image acquisition software |
| Leica DIVE/4TUNE/FALCON | Leica | Leica Dmi8, 2P-M-ready: # 158005406 | Multiphoton Microscope |
| MaiTai HP | Spectra-Physics | Mai Tai DeepSee One Box Ultrafast Laser | Laser for Multiphoton Imaging |
| Masterflex Pump Controller | SPW Industrial | Model: 7553-50 | Peristaltic pump for perfusion |
| Mayo Scissors | FST | 14010-17 | 5” –7” blunt/blunt scissors for decapitation |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5 25x25mm | VWR | 48366-249 | |
| Mini BioMixer | Benchmark Scientific | B3D1020 | shaker/nutator for 37 °C incubator |
| Nikon Ergonomic SMZ1270 | Leica | SMZ1270 | stereomicroscope |
| Paraformaldehyde 16% (formaldehyde aqueous solution) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Hazardous material |
| PBS Tablets, Phosphate-buffered Saline | ThermoFisher Scientific | BP2944100 | Dissolve in Milli-Q water |
| Penicillin-Streptomycin, 200x, Dual Antibiotic Solution | ThermoFisher Scientific | ICN1670249 | |
| Polyvinyl alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Quadrol (N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropylethylenediamine) | Sigma-Aldrich | 122262 | |
| Rabbit anti-DDX4/MVH | Abcam | ab27591 | Dilution 1:500 |
| Rabbit anti-LINE-1 ORF1p | Abcam | ab216324 | Dilution 1:500 |
| Rat anti-TRA98/GCNA | Abcam | ab82527 | Dilution 1:500 |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Hazardous material |
| Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 452882 | Hazardous material |
| Sucrose | ThermoFisher Scientific | S0389 | |
| Tekmar Orbital Shaker | Bimedis | VXR-S10 | shaker for room temperature |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | 90279 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| UNOLOK Infusion Set | MYCO Medical | 7001-23 | needles for perfusion |
| Urea | Amresco | 97061-920 | |
| X-Cite 120LED | Excelitas | S/N XT640-W-0147 | low-power LED fluorescence lamp |
Riferimenti
- Pelosi, E., Forabosco, A., Schlessinger, D. Genetics of the ovarian reserve. Frontiers in Genetics. 6, 308 (2015).
- Pepling, M. E. From primordial germ cell to primordial follicle: mammalian female germ cell development. Genesis. 44 (12), 622-632 (2006).
- Wilkosz, P., Greggains, G. D., Tanbo, T. G., Fedorcsak, P. Female reproductive decline is determined by remaining ovarian reserve and age. PLoS One. 9 (10), 108343 (2014).
- Richardson, M. C., Guo, M., Fauser, B. C. J. M., Macklon, N. S. Environmental and developmental origins of ovarian reserve. Human Reproduction Update. 20 (3), 353-369 (2014).
- Spears, N., et al. Ovarian damage from chemotherapy and current approaches to its protection. Human Reproduction Update. 25 (6), 673-693 (2019).
- Morgan, S., Anderson, R. A., Gourley, C., Wallace, W. H., Spears, N. How do chemotherapeutic agents damage the ovary. Human Reproduction Update. 18 (5), 525-535 (2012).
- Wesevich, V., Kellen, A. N., Pal, L. Recent advances in understanding primary ovarian insufficiency. F1000Research. 9, (2020).
- Biswas, L., et al. Meiosis interrupted: the genetics of female infertility via meiotic failure. Reproduction. 161 (2), 13-35 (2021).
- Tam, P. P., Snow, M. H. Proliferation and migration of primordial germ cells during compensatory growth in mouse embryos. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 64, 133-147 (1981).
- Pepling, M. E., Spradling, A. C. Female mouse germ cells form synchronously dividing cysts. Development. 125 (17), 3323-3328 (1998).
- Pepling, M. E., Spradling, A. C. Mouse ovarian germ cell cysts undergo programmed breakdown to form primordial follicles. Biologia dello sviluppo. 234 (2), 339-351 (2001).
- Adams, I. R., McLaren, A. Sexually dimorphic development of mouse primordial germ cells: switching from oogenesis to spermatogenesis. Development. 129 (5), 1155-1164 (2002).
- McLaren, A., Southee, D. Entry of mouse embryonic germ cells into meiosis. Biologia dello sviluppo. 187 (1), 107-113 (1997).
- Findlay, J. K., Hutt, K. J., Hickey, M., Anderson, R. A. How is the number of primordial follicles in the ovarian reserve established. Biology of Reproduction. 93 (5), 111 (2015).
- Tilly, J. L. Commuting the death sentence: how oocytes strive to survive. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 2 (11), 838-848 (2001).
- Baker, T. G. A quantitative and cytological study of germ cells in human ovaries. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 158, 417-433 (1963).
- Baker, T. G. A quantitative and cytological study of oogenesis in the rhesus monkey. Journal of Anatomy. 100, 761-776 (1966).
- Kurilo, L. F. Oogenesis in antenatal development in man. Human Genetics. 57 (1), 86-92 (1981).
- Matova, N., Cooley, L. Comparative aspects of animal oogenesis. Biologia dello sviluppo. 231 (2), 291-320 (2001).
- Malki, S., vander Heijden, G. W., O’Donnell, K. A., Martin, S. L., Bortvin, A. A role for retrotransposon LINE-1 in fetal oocyte attrition in mice. Developmental Cell. 29 (5), 521-533 (2014).
- Tharp, M. E., Malki, S., Bortvin, A. Maximizing the ovarian reserve in mice by evading LINE-1 genotoxicity. Nature Communications. 11 (1), 330 (2020).
- Rinaldi, V. D., Bolcun-Filas, E., Kogo, H., Kurahashi, H., Schimenti, J. C. The DNA damage checkpoint eliminates mouse oocytes with chromosome synapsis failure. Molecular Cell. 67 (6), 1026-1036 (2017).
- Bolcun-Filas, E., Rinaldi, V. D., White, M. E., Schimenti, J. C. Reversal of female infertility by Chk2 ablation reveals the oocyte DNA damage checkpoint pathway. Science. 343 (6170), 533-536 (2014).
- Pepling, M. E. Follicular assembly: mechanisms of action. Reproduction. 143 (2), 139-149 (2012).
- Tingen, C., Kim, A., Woodruff, T. K. The primordial pool of follicles and nest breakdown in mammalian ovaries. Molecular Human Reproduction. 15 (12), 795-803 (2009).
- Wallace, W. H. B., Kelsey, T. W. Human ovarian reserve from conception to the menopause. PLoS One. 5 (1), 8772 (2010).
- Pepling, M. E., et al. Differences in oocyte development and estradiol sensitivity among mouse strains. Reproduction. 139 (2), 349-357 (2010).
- Nelson, S. M., Anderson, R. A. Prediction of premature ovarian insufficiency: foolish fallacy or feasible foresight. Climacteric. , 1-10 (2021).
- Wood, M. A., Rajkovic, A. Genomic markers of ovarian reserve. Seminars in Reproductive Medicine. 31 (6), 399-415 (2013).
- Tilly, J. L. Ovarian follicle counts–not as simple as 1, 2, 3. Reproductive Biology and Endocrinology. 1, 11 (2003).
- Winship, A. L., Sarma, U. C., Alesi, L. R., Hutt, K. J. Accurate follicle enumeration in adult mouse ovaries. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (164), e61782 (2020).
- Fiorentino, G., Parrilli, A., Garagna, S., Zuccotti, M. Three-dimensional imaging and reconstruction of the whole ovary and testis: a new frontier for the reproductive scientist. Molecular Human Reproduction. 27 (3), 007 (2021).
- Sarma, U. C., Winship, A. L., Hutt, K. J. Comparison of methods for quantifying primordial follicles in the mouse ovary. Journal of Ovarian Research. 13 (1), 121 (2020).
- Skodras, A., Marcelli, G. Computer-generated ovaries to assist follicle counting experiments. PLoS One. 10 (3), 0120242 (2015).
- Sonigo, C., et al. High-throughput ovarian follicle counting by an innovative deep learning approach. Scientific Reports. 8 (1), 13499 (2018).
- Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G. M., Ebling, F. J. P., Kerr, J. B. Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary. Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).
- Kagami, K., Shinmyo, Y., Ono, M., Kawasaki, H., Fujiwara, H. Three-dimensional evaluation of murine ovarian follicles using a modified CUBIC tissue clearing method. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 72 (2018).
- Rinaldi, V. D., Hsieh, K., Munroe, R., Bolcun-Filas, E., Schimenti, J. C. Pharmacological inhibition of the DNA damage checkpoint prevents radiation-induced oocyte death. Genetica. 206 (4), 1823-1828 (2017).
- Malki, S., Tharp, M. E., Bortvin, A. A whole-mount approach for accurate quantitative and spatial assessment of fetal oocyte dynamics in mice. Biology of Reproduction. 93 (5), 113 (2015).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).
- Microscope slide (25×75) with inset for coverslips (22×22). NIH 3D Print Exchange. Capel Lab at Duke University Medical Center Available from: https://3dprint.nih.gov/discover/3DPX-009765 (2018)
- Niu, W., Spradling, A. C. Two distinct pathways of pregranulosa cell differentiation support follicle formation in the mouse ovary. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (33), 20015-20026 (2020).
- Livera, G., Petre-Lazar, B., Guerquin, M. -. J., Trautmann, E., Coffigny, H., Habert, R. p63 null mutation protects mouse oocytes from radio-induced apoptosis. Reproduction. 135 (1), 3-12 (2008).
- Carroll, J., Marangos, P. The DNA damage response in mammalian oocytes. Frontiers in genetics. 4, 117 (2013).
- McKey, J., Cameron, L. A., Lewis, D., Batchvarov, I. S., Capel, B. Combined iDISCO and CUBIC tissue clearing and lightsheet microscopy for in toto analysis of the adult mouse ovary. Biology of Reproduction. 102 (5), 1080-1089 (2020).
- McKey, J., Anbarci, D. N., Bunce, C., Capel, B. Integration of mouse ovary morphogenesis with developmental dynamics of the oviduct, ovarian ligaments, and rete ovarii. bioRxiv. , (2021).
- Udan, R. S., Piazza, V. G., Hsu, C. -. W., Hadjantonakis, A. -. K., Dickinson, M. E. Quantitative imaging of cell dynamics in mouse embryos using light-sheet microscopy. Development. 141 (22), 4406-4414 (2014).
- Di Giovanna, A. P., et al. Tailored sample mounting for light-sheet fluorescence Microscopy of clarified specimens by polydimethylsiloxane casting. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 35 (2019).
