Immunofluorescenza dell'ovaio intero, clearing e microscopia multifotonica per l'analisi quantitativa 3D della riserva ovarica in via di sviluppo nel topo

Summary

Qui, presentiamo un protocollo ottimizzato per l'imaging di intere ovaie per analisi quantitative e qualitative utilizzando immunocolorazione a montaggio intero, microscopia multifotonica e visualizzazione e analisi 3D. Questo protocollo supporta un'elaborazione ad alto rendimento, affidabile e ripetibile applicabile per tossicologia, diagnostica clinica e saggi genomici della funzione ovarica.

Abstract

La fertilità femminile e la durata della vita riproduttiva dipendono dalla qualità e dalla quantità della riserva ovocitaria ovarica. Si stima che l'80% delle cellule germinali femminili che entrano nella profase meiotica I vengano eliminate durante l'attrito fetale degli ovociti (FOA) e la prima settimana di vita postnatale. Tre meccanismi principali regolano il numero di ovociti che sopravvivono durante lo sviluppo e stabiliscono la riserva ovarica nelle femmine che entrano nella pubertà. Nella prima ondata di perdita di ovociti, il 30-50% degli ovociti viene eliminato durante la FOA precoce, un fenomeno che viene attribuito all'elevata espressione dell'elemento nucleare-1 intervallato lungo (LINE-1). La seconda ondata di perdita di ovociti è l'eliminazione degli ovociti con difetti meiotici mediante un checkpoint di qualità meiotico. La terza ondata di perdita di ovociti si verifica perinatale durante la formazione del follicolo primordiale quando alcuni ovociti non riescono a formare follicoli. Non è chiaro cosa regoli ciascuna di queste tre ondate di perdita di ovociti e come modellano la riserva ovarica nei topi o negli esseri umani.

L'immunofluorescenza e la visualizzazione 3D hanno aperto una nuova strada per l'immagine e l'analisi dello sviluppo degli ovociti nel contesto dell'intera ovaia piuttosto che in sezioni 2D meno informative. Questo articolo fornisce un protocollo completo per l'immunocolorazione dell'ovaio intero e la compensazione ottica, producendo preparati per l'imaging utilizzando la microscopia multifotonica e la modellazione 3D utilizzando il software disponibile in commercio. Mostra come questo metodo può essere utilizzato per mostrare la dinamica dell'attrito degli ovociti durante lo sviluppo ovarico nei topi C57BL / 6J e quantificare la perdita di ovociti durante le tre ondate di eliminazione degli ovociti. Questo protocollo può essere applicato alle ovaie prenatali e postnatali precoci per la visualizzazione e la quantificazione degli ovociti, nonché altri approcci quantitativi. È importante sottolineare che il protocollo è stato sviluppato strategicamente per ospitare un'elaborazione ad alto rendimento, affidabile e ripetibile in grado di soddisfare le esigenze in tossicologia, diagnostica clinica e saggi genomici della funzione ovarica.

Introduction

La maggior parte delle femmine di mammifero nascono con un numero finito di ovociti meioticamente arrestati immagazzinati all'interno dei follicoli primordiali, costituendo la riserva ovarica (OR)^1,2. La sala operatoria determina la durata complessiva della vita riproduttiva femminile e la salute³. La sala operatoria normalmente diminuisce di dimensioni con l'invecchiamento e può essere prematuramente impoverita in caso di esposizione a determinati agenti genotossici (radiazioni / chemioterapia) e stress ambientali (malnutrizione), portando a infertilità ^4,5....

Protocol

Tutti i topi utilizzati erano del ceppo genetico C57BL/6J (vedi tabella dei materiali). Questo ceppo è stato completamente sequenziato ed è standard per molti studi sulla struttura e la funzione ovarica. I topi sono stati ospitati secondo le linee guida NIH e le procedure eseguite sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del Jackson Laboratory. I reagenti e le composizioni utilizzati in questo protocollo sono elencati rispettivamente nella Tabella dei materiali e nella Tabella 1.

1. Preparazione dei reagenti

1. Fissativo: Preparare il 4% di pa....

Results

L'immunocolorazione e l'imaging dell'intera ovaia consentono la visualizzazione e la quantificazione dell'espressione di ovociti o proteine nelle ovaie in diversi stadi di sviluppo utilizzando la stessa tecnica e marcatori (Figura 3). Questo protocollo è stato sviluppato per un progetto su larga scala in cui era richiesta l'analisi delle ovaie in più fasi e da più ceppi di topo. Qui presentiamo i dati raccolti per il ceppo C57BL6/J, un ceppo standard per l'analisi genetica. La tecnica qui pr.......

Discussion

Questo articolo presenta un protocollo dettagliato di immunocolorazione e imaging 3D per le ovaie prenatali e postnatali per studi comparativi ad alto rendimento per la quantificazione delle cellule germinali e la localizzazione delle proteine. Abbiamo sviluppato questo protocollo per analizzare il numero di ovociti nelle ovaie (N = 6-12) in sei punti temporali di sviluppo in 10-16 ceppi diversi, dove 2-4 piastre a 24 pozzetti vengono tipicamente elaborate contemporaneamente. Questo metodo può essere adattato per altri o.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
incubatore da banco	Benchmark Scientific	H2200-H	37 gradi Incubatrice C
Albumina sierica bovina (BSA)	VWR	97061-416
C57BL/6J	The Jackson Laboratory	000664	ceppo consanguineo di topo
Dimetil solfossido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D1435	Materiale pericoloso
D-Sorbitolo	Sigma-Aldrich	S6021
Dumont #5 Pinze	FST	91150-20
Barriere reattive FastWells	GraceBio	664113	Guarnizione in silicone appiccicosa e flessibile (pozzetto adesivo)
Forbici fini	FST	91460-11
Glicerolo	Sigma-Aldrich	G2025
Glicina	ThermoFisher Scientific	BP381-500
Anticorpo secondario anti-coniglio IgG (H+L) di capra Cross-Adsorbided, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21246	Diluizione 1:1000
Anticorpo secondario anti-ratto IgG di capra (H+L), Alexa Fluor 555	Invitrogen	A-21434	Diluizione 1:1000
Siero di capra	Sigma-Aldrich	G9023
Software IMARIS	Oxford Instruments	Versione 9.7.0	visualizzazione e analisi delle immagini
Insight X3	Spectra-Physics	InSight  Laser laser ultraveloce sintonizzabile X3	per imaging multifotone Software
LASX	Leica	versione 3.5.6	Software di acquisizione immagini
Leica DIVE/4TUNE/FALCON	Leica	Dmi8, 2P-M-ready: # 158005406	Microscopio multifotone
MaiTai HP	Spectra-Physics	Mai Tai DeepSee One Box Laser ultraveloce	per imaging multifotone
Masterflex Pump Controller	SPW Modello industriale	: 7553-50	Pompa peristaltica per perfusione
Forbici Mayo	FST	14010-17	5" - ndash; 7 pollici forbici smussate/smussate per decapitazione
Micro Cover Glasses, quadrato, n. 1.5 25x25mm	VWR	48366-249
Mini BioMixer	Benchmark Scientific	B3D1020	shaker/nutator per 37 ° Incubatrice C
Nikon Ergonomic SMZ1270	Leica	SMZ1270	stereomicroscopio
Paraformaldeide 16% (soluzione acquosa di formaldeide)	Microscopia elettronica	Scienze 15710	Materiale pericoloso
PBS Compresse, soluzione salina tamponata con fosfato	ThermoFisher Scientific	BP2944100	Sciogliere in acqua Milli-Q
Penicillina-Streptomicina, 200x, doppia soluzione antibiotica	ThermoFisher Scientific	ICN1670249
Alcool polivinilico (PVA)	Sigma-Aldrich	P8136
Quadrol (N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Idrossipropiletilendiammina)	Sigma-Aldrich	122262
Coniglio anti-DDX4/MVH	Abcam	ab27591	Diluizione 1:500
Coniglio anti-LINE-1 ORF1p	Abcam	ab216324	Diluizione 1:500
Ratto anti-TRA98/GCNA	Abcam	ab82527	Diluizione 1:500
Sodio azide	Sigma-Aldrich	S2002	Materiale pericoloso
Boroidruro di sodio	Sigma-Aldrich	452882	Materiale pericoloso
Saccarosio	ThermoFisher Scientific	S0389
Tekmar Orbital Shaker	Bimedis	VXR-S10	agitatore per
trietanolammina	a temperatura ambienteSigma-Aldrich	90279
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
UNOLOK Set di infusione	MYCO Medical	7001-23	aghi per perfusione
Urea	Amresco	97061-920
X-Cite 120LED	Excelitas	S / N XT640-W-0147	lampada a fluorescenza LED a bassa potenza