DNA上に集合したEWS-FLI1凝縮体の1分子イメージング
Summary
ここでは、1分子イメージング法であるDNAカーテンを使用して、DNA上に集合するEWS-FLI1凝縮物の生物物理学的メカニズムを研究します。
Abstract
染色体転座に起因する融合遺伝子は、多くの固形腫瘍または白血病で発見されています。融合癌タンパク質のFUS/EWS/TAF15(FET)ファミリーに属するEWS-FLI1は、ユーイング肉腫において最も頻繁に関与する融合遺伝子の1つです。これらのFETファミリー融合タンパク質は、通常、N末端にFETタンパク質の低複雑性ドメイン(LCD)を、C末端にDNA結合ドメイン(DBD)を持っています。EWS-FLI1は、LCD-LCDおよびLCD-DBD相互作用により、その標的結合遺伝子座で生体分子凝縮物を形成することが確認されており、これらの縮合物はRNAポリメラーゼIIを動員して遺伝子転写を増強することができます。しかし、これらの縮合物が結合部位でどのように組み立てられるかは不明である。最近、EWS-FLI1凝縮物のこれらの組み立てプロセスを視覚化するために、単一分子生物物理学的方法であるDNAカーテンが適用されました。ここでは、標的DNA上に集合する生体分子凝縮物の研究におけるDNAカーテンの適用について、詳細な実験プロトコルとデータ解析アプローチについて説明します。
Introduction
転写調節は、生細胞における正確な遺伝子発現のための重要なステップです。染色体修飾、転写因子(TF)、ノンコーディングRNAなどの多くの要因が、この複雑なプロセスに関与しています1,2,3。これらの因子の中で、TFは、プロモーターまたはエンハンサーとして知られる特定のDNA配列を認識して結合し、続いて転写を活性化または抑制するために他の機能タンパク質を動員することにより、転写調節の特異性に寄与する4,5,6,7。これらのTFがヒトゲノム内の標的部位を検索し、ヒストンおよび非ヒストンDNA結合タンパク質でコーティングされたDNAと相互作用する方法は、何十年にもわたって科学者を困惑させてきました。過去数年間で、TFの標的検索メカニズムに関するいくつかの古典的なモデルが構築され、TFがDNA鎖に沿ってどのように「スライド」、「ホップ」、「ジャンプ」、または「セグメント間移動」するかを説明してきました8、9、10、11。これらのモデルは、単一のTF分子のDNAに対する検索挙動に焦点を当てています。しかし、最近の研究では、一部のTFは、核内で単独で、またはメディエーター複合体12とともに液-液相分離(LLPS)を受けることが示されています。観察されたTFの液滴は、プロモーターまたはエンハンサー領域に関連しており、転写および三次元ゲノムにおける生体分子凝縮物形成の役割を強調している13、14、15。これらの生体分子凝縮物は、in vivoおよびin vitroで膜欠損コンパートメントに結合しています。それらはLLPSを介して形成され、モジュール式の生体高分子とタンパク質の天然変性領域(IDR)が多価相互作用の2つの主要な原動力です16。したがって、TFはDNAを検索するだけでなく、これらの縮合物内で相乗的に機能します4,17,18。今日まで、DNA上のこれらの転写縮合物の生物物理学的特性は不明のままです。
そこで本研究では、1分子法であるDNAカーテンを適用して、TFがDNA上で形成する転写凝縮物の形成と動態をin vitroで直接イメージングすることを目的としていました。タンパク質とDNAの相互作用を研究するためのハイスループットインビトロイメージングプラットフォームであるDNA Curtainsは、DNA修復19、20、21、ターゲットサーチ22、およびLLPS17、23、24に適用されています。DNAカーテンのフローセルは、ビオチン化脂質二重層でコーティングされており、表面を不動態化し、生体分子を表面に拡散させます。ナノ加工されたジグザグパターンは、DNAの動きを制限します。ビオチン化Lambda DNA基質は、バリアエッジに沿って整列し、配向したバッファー流によって引き伸ばすことができます。すべての分子の同じ開始配列と終了配列により、DNA上のタンパク質の追跡が可能になり、結合イベントの位置分布が記述されます25,26。さらに、DNAカーテンと全反射蛍光顕微鏡(TIRFM)の組み合わせにより、バックグラウンドノイズを最小限に抑え、単一分子レベルでシグナルを検出できます。したがって、DNAカーテンは、DNAモチーフ上の転写凝縮物形成のダイナミクスを調査するための有望な方法である可能性があります。本論文では、染色体転座によって生成されたFUS/EWS/TAF15(FET)ファミリー融合癌タンパク質EWS-FLI1の例について説明します。EWS-FLI1分子がDNA上でLLPを受ける様子を観察するためのDNAカーテン実験では×EWS-FLI1分子が27-の結合配列である25GGAAを含むラムダDNAをDNA基質として使用しました。本稿では、実験プロトコルとデータ解析手法について詳細に論じている。
Protocol
Representative Results
Discussion
単一分子アプローチは反応系の内容に非常に敏感であるため、DNAカーテン実験中のすべての材料と溶液、特にセクション1と2で調製された脂質とセクション5で使用されるバッファーの品質を確保するために特別な努力を払う必要があります。バッファーの調製には高純度の試薬を使用し、単一分子アッセイ用にバッファーは新たに調製する必要があります。
500 nM mCherry標…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、NSFC助成金第31670762号(Z.Q.)によってサポートされました。
Materials
| 488 nm diodepumped solid-state laser | Coherent | OBIS488LS | |
| 561 nm diodepumped solid-state laser | Coherent | OBIS561LS | |
| Agar | Rhawn | R003215-50g | |
| biotinylated DOPE | Avanti | 870273P | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7030 | |
| Chloroform | Amresco | 1595C027 | |
| Coating Electra 92 | Allresist GmbH | AR-PC 5090.02 | The conductive protective coating |
| Deoxyribonuclease I bovine | Sigma | D5139-2MG | |
| DOPC | Avanti | 850375P | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Hellmanex III | Sigma | Z805939-1EA | |
| KCl | Sigma | 60130 | |
| Lambda DNA | NEB | N3013S | |
| Lambda Packing Extracts | Epicentre | MP5120 | |
| MgCl2 | Sigma | M2670 | |
| NaCl | Sigma | s3014 | |
| Nanoport | Idex | N-333-01 | |
| NheI-HF | NEB | R3131S | |
| Nikon Inverted Microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| NZCYM Broth | Sigma | N3643-250G | |
| PEG-2000 DOPE | Avanti | 880130P-1G | |
| PEG-8000 | Amresco | 25322-68-3 | |
| PMMA 200K, ETHYL LACTATE 4% | Allresist GmbH | AR-P 649.04 | |
| PMMA 950K, ANISOLE 2% | Allresist GmbH | AR-P 672.02 | |
| Prime 95B Scientific CMOS camera | PHOTOMETRICS | Prime95B | |
| proteinase K | NEB | P8107S | |
| Silica glass slide | G.Finkenbeiner | ||
| Six-way injection valve | Idex | MXP9900-000 | |
| Streptavidin | Thermo | S888 | Diluted with ddH2O |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | Pump11 Elite | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| Tris base | Sigma | T6066 | |
| XhoI | NEB | R0146V | |
| YOYO-1 Iodide (491/509) | Invitrogen | Y3601 | Diluted with DMSO |
Riferimenti
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