自家製ミニバイオリアクターにおける人工多能性幹細胞からの脳オルガノイド発生
Summary
ここでは、ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)から脳オルガノイドを生成するためのプロトコルについて説明する。脳オルガノイドを大量に、高品質で得るために、自家製ミニバイオリアクターを使用しています。
Abstract
iPSC由来の脳オルガノイドは、イン ビトロで 神経系の病理と薬物スクリーニングをモデル化するための有望な技術です。この技術は最近登場しました。それはまだ初期段階にあり、まだ未解決のいくつかの制限があります。現在のプロトコルは、オルガノイドを得ることを薬物発見および前臨床試験のために十分に一貫することを可能にしていない。オルガノイドの成熟には最大1年かかる可能性が高く、研究者は複数の分化プロセスを同時に開始する。それはスペースおよび装置の点で実験室のための付加的な費用を課す。さらに、脳オルガノイドは、多くの場合、栄養と酸素欠乏症に苦しむ中心に壊死領域を持っています。したがって、ほとんどの現行プロトコルは、栄養を改善するために培養培地の循環系を使用する。
一方、オルガノイド栽培のための安価な動的システムやバイオリアクターはありません。本論文では、小型で安価な自家製ミニバイオリアクターで脳オルガノイドを製造するためのプロトコルについて説明する。このプロトコルは、大量に高品質のオルガノイドを得ることができます。
Introduction
ヒトiPSC由来モデルは、神経発達および神経変性疾患の研究に広く使用されている。過去10年間で、3D脳組織モデル、いわゆる脳オルガノイドは、本質的に伝統的な2Dニューロン培養2を補完した。オルガノイドはある程度胚性脳の3Dアーキテクチャを再現し、より正確なモデリングを可能にする。大脳皮質3、4、5、小脳6、中脳、前脳、視床下部7、8、9、海馬10の異なる脳領域を表すオルガノイドの生成のために多くのプロトコルが公開されています。ヒト神経系疾患11を研究するためにオルガノイドを使用する複数の例がある。また、オルガノイドは、薬物発見12に実施され、感染症の研究に使用され、SARS-Cov-213,14を含む。
脳オルガノイドは直径数ミリメートルまで達することができます。だから、オルガノイドの内領域は、低酸素症や栄養失調に苦しみ、最終的に壊死的になることがあります。したがって、多くのプロトコルは、特殊なバイオリアクター8、シェーカー、またはマイクロ流体システム15を含む。これらの装置は、大量の高価な細胞培養培地を必要とするかもしれない。また、このような機器のコストは通常高いです。一部のバイオリアクターは、再利用のために殺菌することが困難になる多くの機械的な部品で構成されています。
ほとんどのプロトコルは、同一のiPSCから得られたオルガノイド間で有意な変動性を生み出す「バッチ効果」16に苦しんでいる。この変動は、薬物検査または均一性を必要とする前臨床試験を妨げる。オルガノイドの収率が高いため、均一なサイズのオルガノイドを選択できるほど、部分的にこの問題を解決できる。
時間係数も重大な問題です。松井ら(2018)は、脳オルガノイドが成熟17に達するまでに少なくとも6ヶ月を要することを示した。Trujilloら(2019)はまた、6ヶ月の培養18の後にのみオルガノイドで電気生理活性が起こったことを実証した。オルガノイド成熟時間が長いため、研究者はしばしば前の分化を完了する前に新しい分化を開始します。分化の複数の並列プロセスには、追加の費用、設備、および実験室スペースが必要です。
我々は最近、主に19上記の問題を解決するミニバイオリアクターを開発しました。この自家製バイオリアクターは、中央にプラスチックノブを備えた超低接着または未処理のペトリ皿で構成されています。このプラスチックノブは、シェーカーの回転によって引き起こされるペトリ皿の中央にオルガノイドとその凝集の混雑を防ぎます。この安価でシンプルな自家製ミニバイオリアクターが、高品質の脳オルガノイドを大量に生成する方法について説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
記載されたプロトコルは、均一なサイズの高品質オルガノイドの生成を可能にする2つの重要なステップを有する。まず、オルガノイドは、細胞数と細胞成熟度がほぼ同じスフェロイドから成長する。第二に、自家製のバイオリアクターは、オルガノイドが群がったりくっつくりしない均一な環境を各オルガノイドに提供します。
細胞の品質と細胞成熟の状態は、プロト?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、ロシア連邦科学高等教育省からの助成金075-15-2019-1669(RT-PCR分析)とロシア科学財団からの助成金No.19-15-00425(他のすべての仕事のために)によって支えられました。著者らはまた、ビデオ編集に彼の助けを借りてパヴェル・ベリコフに感謝します。原稿の中の数字は BioRender.com で作成されました。
Materials
| Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634010 | DMEM/F-12 |
| AggreWell400 | STEMCELL Technologies Inc | 34425 | 24-well culture plate with microwells |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504044 | Neuronal supplement B |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | 200 mM L-alanyl-L-glutamine |
| Human BDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-285 | |
| Human FGF-2 | Miltenyi Biotec | 130-093-839 | |
| Human GDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-290 | |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | Serum replacement |
| mTESR1 | STEMCELL Technologies Inc | 85850 | Pliripotent stem cell medium |
| N2 Supplement | Gibco | 17502001 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | Basal medium for neuronal cell maintenance |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Gibco | 15140130 | |
| Plasmocin | InvivoGen | ant-mpt-1 | Antimicrobials |
| Purmorphamine | EMD Millipore | 540220 | |
| StemMACS Y27632 | Miltenyi Biotec | 130-106-538 | Y27632 |
| StemMACS Dorsomorphin | Miltenyi Biotec | 130-104-466 | Dorsomorphin |
| StemMACS LDN-193189 | Miltenyi Biotec | 130-106-540 | LDN-193189 |
| StemMACS SB431542 | Miltenyi Biotec | 130-106-543 | SB431542 |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 15250061 | |
| Versen solution | Gibco | 15040066 | 0.48 mM EDTA in PBS |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350010 |
Riferimenti
- Marchetto, M. C., Winner, B., Gage, F. H. Pluripotent stem cells in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases. Human Molecular Genetics. 19, 71-76 (2010).
- Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F. 3D brain Organoids derived from pluripotent stem cells: promising experimental models for brain development and neurodegenerative disorders. Journal of Biomedical Science. 24 (1), 1-12 (2017).
- Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 110 (50), 20284 (2013).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Xiang, Y., et al. Fusion of regionally specified hPSC derived organoids models human brain development and interneuron migration. Cell Stem Cell. 21, 383-398 (2017).
- Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells. Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).
- Qian, X., et al. Brain region specific organoids using mini bioreactors for modeling ZIKV exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Qian, X., et al. Generation of human brain region specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
- Jo, J., et al. Midbrain like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuro melanin producing neurons. Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).
- Sakaguchi, H., et al. Generation of functional hippocampal neurons from self-organizing human embryonic stem cell derived dorsomedial telencephalic tissue. Nature Communication. 6 (1), 8896 (2015).
- Di Lullo, E., Kriegstein, A. R. The use of brain organoids to investigate neural development and disease. Nature Reviews Neuroscience. 18 (10), 573-584 (2017).
- Chen, K. G., et al. Pluripotent stem cell platforms for drug discovery. Trends in Molecular Medicine. 24 (9), 805-820 (2018).
- Dang, J., et al. Zika virus depletes neural progenitors in human cerebral organoids through activation of the innate immune receptor TLR3. Cell Stem Cell. 19 (2), 258-265 (2016).
- Tiwari, S. K., Wang, S., Smith, D., Carlin, A. F., Rana, T. M. Revealing tissue-specific SARS-CoV-2 infection and host responses using human stem cell-derived lung and cerebral organoids. Stem Cell Reports. 16 (3), 437-445 (2021).
- Ao, Z., et al. One-stop microfluidic assembly of human brain organoids to model prenatal cannabis exposure. Analytical Chemistry. 92 (6), 4630-4638 (2020).
- Di Nardo, P., Parker, G. C. Stem cell standardization. Stem Cells Development. 20 (3), 375-377 (2011).
- Jo, J., Xiao, Y., et al. Midbrain like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuro melanin producing neurons. Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).
- Matsui, T. K., et al. Six-month cultured cerebral organoids from human ES cells contain matured neural cells. Neuroscience Letters. 670, 75-82 (2018).
- Trujillo, C. A., et al. Complex oscillatory waves emerging from cortical organoids model early human brain network development. Cell Stem Cell. 25 (4), 558-569 (2019).
- Eremeev, A. V., et al. Necessity Is the mother of invention” or inexpensive, reliable, and reproducible protocol for generating organoids. Biochemistry (Moscow). 84 (3), 321-328 (2019).
- Qian, X., et al. Generation of human brain region–specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13, 565-580 (2018).
- Matsui, T. K., Tsuru, Y., Hasegawa, K., Kuwako, K. I. Vascularization of human brain organoids. Stem Cells. 39 (8), 1017-1024 (2021).
- Hall, G. N., et al. Patterned, organoid-based cartilaginous implants exhibit zone specific functionality forming osteochondral-like tissues in vivo. Biomaterials. 273, 120820 (2021).
- Zachos, N. C., et al. Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology. Journal of Biological Chemistry. 291, 3759-3766 (2016).
- Eremeev, A., et al. Cerebral organoids—challenges to establish a brain prototype. Cells. 10 (7), 1790 (2021).
- Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES Cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 110, 20284-20289 (2013).
