Qui descriviamo un protocollo per la generazione di organoidi cerebrali da cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC). Per ottenere organoidi cerebrali in grandi quantità e di alta qualità, utilizziamo mini bioreattori fatti in casa.
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Articolo metodologico
Generazione di organoidi cerebrali da cellule staminali pluripotenti indotte in mini bioreattori fatti in casa
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'organoide cerebrale derivato da iPSC è una tecnologia promettente per la modellazione in vitro delle patologie del sistema nervoso e lo screening farmacologico. Questa tecnologia è emersa di recente. È ancora agli inizi e ha alcune limitazioni ancora irrisolte. Gli attuali protocolli non consentono di ottenere organoidi sufficientemente coerenti per la scoperta di farmaci e studi preclinici. La maturazione degli organoidi può richiedere fino a un anno, spingendo i ricercatori a lanciare più processi di differenziazione contemporaneamente. Impone costi aggiuntivi per il laboratorio in termini di spazio e attrezzature. Inoltre, gli organoidi cerebrali hanno spesso una zona necrotica al centro, che soffre di carenza di nutrienti e ossigeno. Quindi, la maggior parte dei protocolli attuali utilizza un sistema circolante per il terreno di coltura per migliorare la nutrizione.
Nel frattempo, non ci sono sistemi dinamici economici o bioreattori per la coltivazione di organoidi. Questo documento descrive un protocollo per la produzione di organoidi cerebrali in mini bioreattori fatti in casa compatti ed economici. Questo protocollo consente di ottenere organoidi di alta qualità in grandi quantità.
Introduzione
I modelli umani derivati da iPSC sono ampiamente utilizzati negli studi sui disturbi dello sviluppo neurologico e neurodegenerativo1. Negli ultimi dieci anni, i modelli di tessuto cerebrale 3D, i cosiddetti organoidi cerebrali, hanno essenzialmente completato le tradizionali colture neuronali 2D2. Gli organoidi ricapitolano in una certa misura l'architettura 3D del cervello embrionale e consentono una modellazione più precisa. Molti protocolli sono pubblicati per la generazione di organoidi che rappresentano diverse regioni del cervello: corteccia cerebrale3,4,
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Protocollo
NOTA: utilizzare la tecnica sterile in tutto il protocollo, esclusi i passaggi 1.2 e 1.3. Riscaldare tutti i mezzi di coltura e le soluzioni a 37 °C prima di applicarli a cellule o organoidi. Coltivare le cellule in un incubatore a CO2 a 37 °C in 5% CO2 su 80% di umidità. Lo schema di protocollo è illustrato nella Figura 1.
1. Trasformare le piastre di Petri in mini bioreattori
- Tagliare tubi centrifughi sterili da 15 ml in anelli di 7-8 mm di altezza; autoclave gli anelli.
- Rompere le piastre di Petri a bassa adesione, non trattate o microbiologiche in b....
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Risultati
Lo schema di protocollo è illustrato nella Figura 1. Il protocollo includeva cinque media in cui le iPSC si differenziavano in organoidi cerebrali per almeno un mese. La differenziazione è stata avviata quindi le iPSC hanno raggiunto la confluenza del 75-90% (Figura 2A,B). I primi segni di differenziazione verso i neuroni sono stati osservati nei giorni 10-11 della coltivazione di iPSC nel mezzo A, quando le cellule hanno iniziato a raggrupparsi.......
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Discussione
Il protocollo descritto ha due passaggi cruciali che consentono la generazione di organoidi di alta qualità di dimensioni uniformi. In primo luogo, gli organoidi crescono da sferoidi che sono quasi identici nel numero di cellule e nella maturità cellulare. In secondo luogo, i bioreattori fatti in casa forniscono a ciascun organoide un ambiente uniforme, in cui gli organoidi non si affollano o si attaccano insieme.
La qualità cellulare e lo stato di maturazione cellulare sono essenziali per ese.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione 075-15-2019-1669 del Ministero della Scienza e dell'Istruzione Superiore della Federazione Russa (analisi RT-PCR) e dalla sovvenzione n. 19-15-00425 della Russian Science Foundation (per tutti gli altri lavori). Gli autori ringraziano anche Pavel Belikov per il suo aiuto con l'editing video. Le figure nel manoscritto sono state create con BioRender.com.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634010 | DMEM/F-12 |
| AggreWell400 | STEMCELL Technologies Inc | 34425 | Piastra di coltura a 24 pozzetti con micropozzetti |
| Integratore B-27 | Gibco | 17504044 | Integratore neuronale B |
| GlutaMAX Integratore | Gibco | 35050061 | 200 mM L-alanil-L-glutammina |
| BDNF umano | Miltenyi Biotec | 130-096-285 | |
| Umano FGF-2 | Miltenyi Biotec | 130-093-839 | |
| Umano GDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-290 | |
| KnockOut Siero di Ricambio | Gibco | 10828028 | Siero di Ricambio |
| mTESR1 | STEMCELL Technologies Inc | 85850 | Pliripotente Cellule staminali |
| Medium N2 Integratore | Gibco | ||
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | Terreno basale per il mantenimento delle cellule neuronali |
| Soluzione di penicillina-streptomicina | Gibco | 15140130 | |
| Plasmocin | InvivoGen | ant-mpt-1 | Antimicrobici |
| Purmorphamine | EMD Millipore | 540220 | |
| StemMACS Y27632 | Miltenyi Biotec | 130-106-538 | Y27632 |
| StemMACS Dorsomorphin | Miltenyi Biotec | 130-104-466 | Dorsomorphin |
| StemMACS LDN-193189 | Miltenyi Biotec | 130-106-540 | LDN-193189 |
| StemMACS SB431542 | Miltenyi Biotec | 130-106-543 | SB431542 |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 15250061 | |
| Versen solution | Gibco | 15040066 | 0,48 mM EDTA in PBS |
| β-mercaptoetanolo | Gibco | 31350010 |
Riferimenti
- Marchetto, M. C., Winner, B., Gage, F. H. Pluripotent stem cells in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases. Human Molecular Genetics. 19, 71-76 (2010).
- Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F.
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Ristampe e permessi
