Génération d’organoïdes cérébraux à partir de cellules souches pluripotentes induites dans des mini-bioréacteurs faits maison
Summary
Nous décrivons ici un protocole pour générer des organoïdes cérébraux à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (CSI). Pour obtenir des organoïdes cérébraux en grande quantité et de haute qualité, nous utilisons des mini-bioréacteurs faits maison.
Abstract
L’organoïde cérébral dérivé de l’iPSC est une technologie prometteuse pour la modélisation in vitro des pathologies du système nerveux et le dépistage des médicaments. Cette technologie a émergé récemment. Il en est encore à ses balbutiements et a encore certaines limites non résolues. Les protocoles actuels ne permettent pas d’obtenir des organoïdes de manière suffisamment cohérente pour la découverte de médicaments et les études précliniques. La maturation des organoïdes peut prendre jusqu’à un an, poussant les chercheurs à lancer plusieurs processus de différenciation simultanément. Il impose des coûts supplémentaires pour le laboratoire en termes d’espace et d’équipement. En outre, les organoïdes cérébraux ont souvent une zone nécrotique au centre, qui souffre d’une carence en nutriments et en oxygène. Par conséquent, la plupart des protocoles actuels utilisent un système de circulation pour le milieu de culture afin d’améliorer la nutrition.
Pendant ce temps, il n’y a pas de systèmes dynamiques peu coûteux ou de bioréacteurs pour la culture d’organoïdes. Cet article décrit un protocole pour la production d’organoïdes cérébraux dans des mini-bioréacteurs compacts et peu coûteux fabriqués à la maison. Ce protocole permet d’obtenir des organoïdes de haute qualité en grande quantité.
Introduction
Les modèles humains dérivés de l’iPSC sont largement utilisés dans les études des troubles neurodéveloppementaux et neurodégénératifs1. Au cours de la dernière décennie, les modèles de tissus cérébraux 3D, appelés organoïdes cérébraux, ont essentiellement complété les cultures neuronales 2D traditionnelles2. Les organoïdes récapitulent dans une certaine mesure l’architecture 3D du cerveau embryonnaire et permettent une modélisation plus précise. De nombreux protocoles sont publiés pour la génération d’organoïdes représentant différentes régions du cerveau : cortex cérébral3,4,5,cervelet6,mésencéphale, cerveau antérieur, hypothalamus7,8,9et hippocampe10. Il y a eu de multiples exemples d’utilisation d’organoïdes pour étudier les maladies du système nerveux humain11. En outre, les organoïdes ont été mis en œuvre dans les découvertes de médicaments12 et utilisés dans des études sur les maladies infectieuses, y compris le SARS-Cov-213,14.
Les organoïdes cérébraux peuvent atteindre plusieurs millimètres de diamètre. Ainsi, la zone interne de l’organoïde peut souffrir d’hypoxie ou de malnutrition et éventuellement devenir nécrotique. Par conséquent, de nombreux protocoles incluent des bioréacteurs spéciaux8,des agitateurs ou des systèmes microfluidiques15. Ces dispositifs peuvent nécessiter de grands volumes de milieux de culture cellulaire coûteux. En outre, le coût d’un tel équipement est généralement élevé. Certains bioréacteurs sont constitués de nombreuses pièces mécaniques qui les rendent difficiles à stériliser pour les réutiliser.
La plupart des protocoles souffrent de « l’effet batch »16, qui génère une variabilité significative entre les organoïdes obtenus à partir des cSI identiques. Cette variabilité entrave les tests de dépistage de drogues ou les études précliniques nécessitant une uniformité. Le rendement élevé des organoïdes suffisant pour sélectionner des organoïdes de taille uniforme peut résoudre partiellement ce problème.
Le facteur temps est également un problème important. Matsui et al. (2018) ont montré que les organoïdes cérébraux ont besoin d’au moins six mois pour atteindrela maturité 17. Trujillo et al. (2019) ont également démontré que l’activité électrophysiologique ne se produisait dans les organoïdes qu’après six mois de culture18. En raison du long temps de maturation des organoïdes, les chercheurs lancent souvent une nouvelle différenciation avant de terminer la précédente. De multiples processus parallèles de différenciation nécessitent des dépenses, des équipements et des espaces de laboratoire supplémentaires.
Nous avons récemment développé un mini bioréacteur qui résout principalement les problèmes mentionnés ci-dessus19. Ce bioréacteur fait maison se compose d’une boîte de Petri à très faible adhérence ou non traitée avec un bouton en plastique au centre. Ce bouton en plastique empêche l’encombrement des organoïdes et leur conglutination au centre de la boîte de Pétri, qui est causée par la rotation du shaker. Cet article décrit comment ce mini bioréacteur maison peu coûteux et simple permet de générer des organoïdes cérébraux de haute qualité en grande quantité.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit comporte deux étapes cruciales permettant la génération d’organoïdes de haute qualité de taille uniforme. Tout d’abord, les organoïdes se développent à partir de sphéroïdes qui sont presque identiques en nombre de cellules et en maturité cellulaire. Deuxièmement, les bioréacteurs faits maison fournissent à chaque organoïde un environnement uniforme, où les organoïdes ne s’encombrent pas ou ne collent pas ensemble.
La qualité cellulaire et l’état …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la subvention 075-15-2019-1669 du ministère de la Science et de l’Enseignement supérieur de la Fédération de Russie (analyse RT-PCR) et par la subvention n ° 19-15-00425 de la Fondation russe pour la science (pour tous les autres travaux). Les auteurs remercient également Pavel Belikov pour son aide au montage vidéo. Les figures du manuscrit ont été créées avec BioRender.com.
Materials
| Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634010 | DMEM/F-12 |
| AggreWell400 | STEMCELL Technologies Inc | 34425 | 24-well culture plate with microwells |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504044 | Neuronal supplement B |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | 200 mM L-alanyl-L-glutamine |
| Human BDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-285 | |
| Human FGF-2 | Miltenyi Biotec | 130-093-839 | |
| Human GDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-290 | |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | Serum replacement |
| mTESR1 | STEMCELL Technologies Inc | 85850 | Pliripotent stem cell medium |
| N2 Supplement | Gibco | 17502001 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | Basal medium for neuronal cell maintenance |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Gibco | 15140130 | |
| Plasmocin | InvivoGen | ant-mpt-1 | Antimicrobials |
| Purmorphamine | EMD Millipore | 540220 | |
| StemMACS Y27632 | Miltenyi Biotec | 130-106-538 | Y27632 |
| StemMACS Dorsomorphin | Miltenyi Biotec | 130-104-466 | Dorsomorphin |
| StemMACS LDN-193189 | Miltenyi Biotec | 130-106-540 | LDN-193189 |
| StemMACS SB431542 | Miltenyi Biotec | 130-106-543 | SB431542 |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 15250061 | |
| Versen solution | Gibco | 15040066 | 0.48 mM EDTA in PBS |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350010 |
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