Her beskriver vi en protokol til generering af hjerneorganoider fra menneskeskabte pluripotente stamceller (iPSC’er). For at opnå hjerneorganoider i store mængder og af høj kvalitet bruger vi hjemmelavede minibioreaktorer.
Den iPSC-afledte hjerneorganoid er en lovende teknologi til in vitro-modellering af patologierne i nervesystemet og lægemiddelscreening. Denne teknologi er opstået for nylig. Det er stadig i sin vorden og har nogle begrænsninger uløst endnu. De nuværende protokoller tillader ikke at opnå organoider at være konsekvent nok til opdagelse af lægemidler og prækliniske undersøgelser. Modningen af organoider kan tage op til et år og presse forskerne til at lancere flere differentieringsprocesser samtidigt. Det pålægger laboratoriet yderligere omkostninger med hensyn til plads og udstyr. Derudover har hjerneorganoider ofte en nekrotisk zone i midten, som lider af næringsstof og iltmangel. Derfor bruger de fleste nuværende protokoller et cirkulerende system til kulturmedium til at forbedre ernæringen.
I mellemtiden er der ingen billige dynamiske systemer eller bioreaktorer til organoid dyrkning. Dette papir beskriver en protokol til fremstilling af hjerneorganoider i kompakte og billige hjemmelavede minibioreaktorer. Denne protokol gør det muligt at opnå organoider af høj kvalitet i store mængder.
Humane iPSC-afledte modeller anvendes i vid udstrækning i undersøgelserne af neuroudviklingsmæssige og neurodegenerative lidelser1. I løbet af det seneste årti har 3D-hjernevævsmodeller, såkaldte hjerneorganoider, i det væsentlige suppleret traditionelle 2D neuronale kulturer2. Organoiderne generobrer til en vis grad den embryonale hjernes 3D-arkitektur og tillader mere præcis modellering. Mange protokoller er offentliggjort for generering af organoider, der repræsenterer forskellige hjerneområder: cerebral cortex3,4,5, lillehjern6, midbrain, forhjern, hypothalamus7,8,9og hippocampus10. Der har været flere eksempler på at bruge organoider til at studere sygdomme i menneskers nervesystem11. Organoiderne blev også implementeret i lægemiddelfund12 og anvendes i undersøgelser af smitsomme sygdomme, herunder SARS-Cov-213,14.
Hjernen organoider kan nå op til flere millimeter i diameter. Så den indre zone af organoid kan lide af hypoxi eller underernæring og i sidste ende blive nekrotisk. Derfor omfatter mange protokoller specielle bioreaktorer8,shakere eller mikrofluidiske systemer15. Disse enheder kan kræve store mængder dyre cellekulturmedier. Omkostningerne ved sådant udstyr er også normalt høje. Nogle bioreaktorer består af mange mekaniske dele, der gør dem vanskelige at sterilisere til genbrug.
De fleste protokoller lider af “batcheffekten”16, som genererer betydelig variation blandt organoider opnået fra de identiske iPSCs. Denne variation hindrer dopingtest eller prækliniske undersøgelser, der kræver ensartethed. Det høje udbytte af organoider nok til at vælge organoider af ensartet størrelse kan delvist løse dette problem.
Tidsfaktoren er også et væsentligt problem. Matsui et al. (2018) viste, at hjerneorganoider kræver mindst seks måneder for at nå modenhed17. Trujillo et al. (2019) viste også, at elektrofysiologisk aktivitet først forekom i organoider efter seks måneders dyrkning18. På grund af den lange organoid modningstid lancerer forskerne ofte ny differentiering, før de afslutter den foregående. Flere parallelle processer for differentiering kræver yderligere udgifter, udstyr og laboratorieplads.
Vi har for nylig udviklet en mini bioreaktor, der primært løser de ovennævnte problemer. Denne hjemmelavede bioreaktor består af en ultra-lav vedhæftning eller ubehandlet petriskål med en plastikknap i midten. Denne plast drejeknap forhindrer fortrængning af organoider og deres conglutination i midten af Petri parabol, som er forårsaget af rotation af shaker. Dette papir beskriver, hvordan denne billige og enkle hjemmelavede minibioreaktor gør det muligt at generere hjerneorganoider af høj kvalitet i store mængder.
Den beskrevne protokol har to afgørende skridt, der gør det muligt at frembringe organoider af høj kvalitet af ensartet størrelse. For det første vokser organoiderne fra spheroider, der er næsten identiske i celletal og cellemodenhed. For det andet giver de hjemmelavede bioreaktorer hver organoid et ensartet miljø, hvor organoider ikke fortrænger eller holder sammen.
Cellekvaliteten og tilstanden af cellemodning er afgørende for at udføre protokollen. Det er afgørende at starte neur…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af tilskud 075-15-2019-1669 fra Ministeriet for Videnskab og Videregående Uddannelse i Den Russiske Føderation (RT-PCR-analyse) og ved tilskud nr. 19-15-00425 fra Den Russiske Videnskabsfond (for alt andet arbejde). Forfatterne takker også Pavel Belikov for hans hjælp med videoredigeringen. Figurer i manuskriptet blev skabt med BioRender.com.
Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634010 | DMEM/F-12 |
AggreWell400 | STEMCELL Technologies Inc | 34425 | 24-well culture plate with microwells |
B-27 Supplement | Gibco | 17504044 | Neuronal supplement B |
GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | 200 mM L-alanyl-L-glutamine |
Human BDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-285 | |
Human FGF-2 | Miltenyi Biotec | 130-093-839 | |
Human GDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-290 | |
KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | Serum replacement |
mTESR1 | STEMCELL Technologies Inc | 85850 | Pliripotent stem cell medium |
N2 Supplement | Gibco | 17502001 | |
Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | Basal medium for neuronal cell maintenance |
Penicillin-Streptomycin Solution | Gibco | 15140130 | |
Plasmocin | InvivoGen | ant-mpt-1 | Antimicrobials |
Purmorphamine | EMD Millipore | 540220 | |
StemMACS Y27632 | Miltenyi Biotec | 130-106-538 | Y27632 |
StemMACS Dorsomorphin | Miltenyi Biotec | 130-104-466 | Dorsomorphin |
StemMACS LDN-193189 | Miltenyi Biotec | 130-106-540 | LDN-193189 |
StemMACS SB431542 | Miltenyi Biotec | 130-106-543 | SB431542 |
Trypan Blue Solution | Gibco | 15250061 | |
Versen solution | Gibco | 15040066 | 0.48 mM EDTA in PBS |
β-mercaptoethanol | Gibco | 31350010 |