इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए ग्रिड के लक्षित क्षेत्रों में सेल आसंजन और विकास को निर्देशित करना है। यह एक एंटी-फाउलिंग परत को लागू करके प्राप्त किया जाता है जो उपयोगकर्ता-निर्दिष्ट पैटर्न में एब्लेटेड होता है, जिसके बाद सेल सीडिंग से पहले पैटर्न वाले क्षेत्रों में अतिरिक्त-सेलुलर मैट्रिक्स प्रोटीन का जमाव होता है।
होल-सेल क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी (क्रायो-ईटी) एक शक्तिशाली तकनीक है जिसका उपयोग सेलुलर संदर्भ में मौजूद मैक्रोमोलेक्यूल्स की नैनोमीटर-स्तर की रिज़ॉल्यूशन संरचनाओं का उत्पादन करने के लिए किया जाता है और निकट-देशी जमे हुए-हाइड्रेटेड राज्य में संरक्षित किया जाता है। हालांकि, टीईएम ग्रिड पर कोशिकाओं को संवर्धित करने और / या पालन करने से जुड़ी चुनौतियां हैं जो कोशिकाओं को उनकी शारीरिक स्थिति में बनाए रखते हुए टोमोग्राफी के लिए उपयुक्त है। यहां, टीईएम ग्रिड पर यूकेरियोटिक सेल विकास को निर्देशित करने और बढ़ावा देने के लिए माइक्रोपैटर्निंग के उपयोग पर एक विस्तृत चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। माइक्रोपैटर्निंग के दौरान, सेल विकास को टीईएम ग्रिड की पन्नी पर निर्दिष्ट पैटर्न और पदों के भीतर अतिरिक्त-सेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रोटीन जमा करके निर्देशित किया जाता है, जबकि अन्य क्षेत्र एंटी-फाउलिंग परत के साथ लेपित रहते हैं। सतह कोटिंग और पैटर्न डिजाइन की पसंद में लचीलापन माइक्रोपैटर्निंग को सेल प्रकारों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए व्यापक रूप से लागू करता है। माइक्रोपैटर्निंग व्यक्तिगत कोशिकाओं के भीतर संरचनाओं के अध्ययन के साथ-साथ मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन या विभेदित बहु-सेलुलर समुदायों जैसे अधिक जटिल प्रयोगात्मक प्रणालियों के अध्ययन के लिए उपयोगी है। Micropatterning को कई डाउनस्ट्रीम पूरे-सेल क्रायो-ईटी वर्कफ़्लो में भी एकीकृत किया जा सकता है, जिसमें correlative light and electron microscopy (cryo-CLEM) और focused-ion beam milling (cryo-FIB) शामिल हैं।
क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) के विकास, विस्तार और बहुमुखी प्रतिभा के साथ, शोधकर्ताओं ने मैक्रोमोलेक्यूलर (~ 1 एनएम) से उच्च (~ 2 Å) संकल्प तक एक निकट-देशी राज्य में जैविक नमूनों की एक विस्तृत श्रृंखला की जांच की है। एकल-कण क्रायो-ईएम और इलेक्ट्रॉन विवर्तन तकनीकों को क्रमशः समाधान में या क्रिस्टलीय अवस्था में शुद्ध मैक्रोमोलेक्यूल्स पर सबसे अच्छा लागू किया जाता है। जबकि क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी (क्रायो-ईटी) बैक्टीरिया, प्लियोमॉर्फिक वायरस और यूकेरियोटिक कोशिकाओं जैसे बड़े, हेटरोलॉगस वस्तुओं के निकट-देशी संरचनात्मक और अल्ट्रास्ट्रक्चरल अध्ययन के लिए विशिष्ट रूप से उपयुक्त है। क्रायो-ईटी में, तीन आयामी (3 डी) जानकारी को माइक्रोस्कोप चरण पर नमूने को शारीरिक रूप से झुकाकर और विभिन्न कोणों पर नमूने के माध्यम से छवियों की एक श्रृंखला प्राप्त करके प्राप्त किया जाता है। ये छवियां, या झुकाव-श्रृंखला, अक्सर एक-से-तीन-डिग्री वृद्धि में +60 /-60 डिग्री की सीमा को कवर करती हैं। झुकाव-श्रृंखला को तब कम्प्यूटेशनल रूप से 3 डी वॉल्यूम में पुनर्निर्मित किया जा सकता है, जिसे टोमोग्राम 4 के रूप में भी जाना जाता है।
सभी क्रायो-ईएम तकनीकों के लिए नमूने को अनाकार, गैर-क्रिस्टलीय, विट्रियस बर्फ की एक पतली परत में एम्बेडेड करने की आवश्यकता होती है। सबसे अधिक इस्तेमाल की जाने वाली क्रायो-फिक्सेशन तकनीकों में से एक डुबकी ठंड है, जहां नमूना ईएम ग्रिड पर लागू होता है, धब्बा लगाया जाता है, और तेजी से तरल इथेन या तरल एथेन और प्रोपेन के मिश्रण में डूब जाता है। यह तकनीक <100 एनएम से ~ 10 μm मोटाई में नमूनों के विट्रीफिकेशन के लिए पर्याप्त है, जिसमें सुसंस्कृत मानव कोशिकाएं शामिल हैं, जैसे कि हेला कोशिकाएं 5,6। मोटे नमूने, जैसे मिनी-ऑर्गेनोइड्स या ऊतक बायोप्सी, मोटाई में 200 μm तक, उच्च दबाव ठंड 7 द्वारा विट्रिफाइड किया जा सकता है। हालांकि, मोटे नमूनों के इलेक्ट्रॉन प्रकीर्णन में वृद्धि के कारण, क्रायो-ईटी के लिए नमूना और बर्फ की मोटाई 300 केवी ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में ~ 0.5 – 1 μm तक सीमित है। इसलिए, कई यूकेरियोटिक कोशिकाओं के पूरे सेल क्रायो-ईटी सेल परिधि या कोशिकाओं के एक्सटेंशन तक सीमित है जब तक कि अतिरिक्त नमूना तैयारी चरणों का उपयोग नहीं किया जाता है, जैसे क्रायो-सेक्शनिंग 8 या केंद्रित-आयन बीम मिलिंग 9,10,11।
कई पूरे सेल क्रायो-ईटी इमेजिंग प्रयोगों की एक सीमा डेटा संग्रह थ्रूपुट 12 है। एकल-कण क्रायो-ईएम के विपरीत, जहां हजारों अलग-अलग कणों को अक्सर एक एकल टीईएम ग्रिड वर्ग से चित्रित किया जा सकता है, कोशिकाएं बड़ी, फैल-आउट होती हैं, और कोशिकाओं को विट्रियस बर्फ की एक पतली परत में संरक्षित करने की अनुमति देने के लिए कम घनत्व पर उगाया जाना चाहिए। अक्सर ब्याज का क्षेत्र सेल की एक विशेष विशेषता या उप-क्षेत्र तक सीमित होता है। आगे सीमित थ्रूपुट उन क्षेत्रों पर बढ़ने के लिए कोशिकाओं की प्रवृत्ति है जो टीईएम इमेजिंग के लिए उपयुक्त नहीं हैं, जैसे कि टीईएम ग्रिड सलाखों पर या उसके पास। टीईएम ग्रिड पर सेल संस्कृति से जुड़े अप्रत्याशित कारकों के कारण, डेटा अधिग्रहण के लिए नमूना पहुंच और थ्रूपुट में सुधार करने के लिए तकनीकी विकास की आवश्यकता होती है।
अनुयायी अतिरिक्त सेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रोटीन के साथ सब्सट्रेट माइक्रोपैटर्निंग लाइव-सेल लाइट माइक्रोस्कोपी के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित तकनीक है जो कठोर, टिकाऊ और ऑप्टिकल रूप से पारदर्शी सतहों जैसे कि ग्लास और अन्य ऊतक संस्कृति सब्सट्रेट्स 13,14 पर कोशिकाओं के विकास को निर्देशित करती है। माइक्रोपैटर्निंग को नरम और / या तीन आयामी (3 डी) सतहों पर भी किया गया है। इस तरह की तकनीकों ने न केवल कोशिकाओं की सटीक स्थिति के लिए अनुमति दी है; उन्होंने बहुकोशिकीय नेटवर्क के निर्माण का भी समर्थन किया है, जैसे कि पैटर्न वाले तंत्रिका सेल सर्किट 15। क्रायो-ईटी में माइक्रोपैटर्निंग लाने से न केवल थ्रूपुट में वृद्धि होगी, बल्कि यह जटिल और गतिशील सेलुलर माइक्रोएन्वायरमेंट की खोज के लिए नए अध्ययन भी खोल सकता है।
हाल ही में, कई समूहों ने कई दृष्टिकोणों के माध्यम से TEM ग्रिड पर micropatterning तकनीकों का उपयोग करना शुरू कर दिया है16,17। यहां, TEM ग्रिड के लिए एक maskless photopatterning तकनीक का उपयोग Alvéole PRIMO micropatterning प्रणाली है, जो उच्च संकल्प और संपर्क रहित patterning सुविधाएँ का उपयोग कर वर्णित है. इस micropatterning प्रणाली के साथ, एक विरोधी fouling परत सब्सट्रेट के शीर्ष पर लागू किया जाता है, एक फोटोकैटालिस्ट के आवेदन के बाद और एक यूवी लेजर के साथ उपयोगकर्ता परिभाषित पैटर्न में विरोधी fouling परत के ablation द्वारा पीछा किया. ईसीएम प्रोटीन को तब उपयुक्त सेल संस्कृति के लिए पैटर्न में जोड़ा जा सकता है। इस विधि का उपयोग रेटिना वर्णक उपकला -1 (आरपीई 1), मैडिन-डार्बी कैनाइन किडनी -II (एमडीसीकेआईआई), मानव चमड़ी फाइब्रोब्लास्ट (एचएफएफ), और एंडोथेलियल सेल लाइनों 16,17,18 के क्रायो-ईटी अध्ययन के लिए कई समूहों द्वारा किया गया है। यह micropatterning प्रणाली कई विरोधी fouling परत substrates के रूप में के रूप में अच्छी तरह से या तो एक तरल या जेल photocatalyst अभिकर्मक के साथ संगत है. विभिन्न प्रकार के ईसीएम प्रोटीन को सेल लाइन की विशिष्टता के लिए चुना और अनुकूलित किया जा सकता है, जो उपयोगकर्ता के लिए बहुमुखी प्रतिभा प्रदान करता है।
Micropatterning सफलतापूर्वक प्रयोगशाला 19 के भीतर परियोजनाओं की एक संख्या के लिए लागू किया गया है। यहां, एक माइक्रोपैटर्निंग प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है, जिसमें सुसंस्कृत हेला कोशिकाओं, श्वसन सिंक्टियल वायरस (आरएसवी) -संक्रमित बीईएएस -2 बी कोशिकाओं और प्राथमिक लार्वा ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर न्यूरॉन्स 20 का अध्ययन करने के लिए विशिष्ट अनुकूलन शामिल हैं।
आधुनिक, उन्नत इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप और सॉफ्टवेयर पैकेज अब सुव्यवस्थित स्वचालित क्रायो-ईएम और क्रायो-ईटी डेटा संग्रह का समर्थन करते हैं जहां सैकड़ों से हजारों पदों को लक्षित किया जा सकता है और कुछ दिनों के भीतर चित्रित किया जा सकता है32,33,34,35। पूरे सेल क्रायो-ईटी वर्कफ़्लो के लिए एक महत्वपूर्ण सीमित कारक प्रति ग्रिड संग्रहणीय लक्ष्यों की पर्याप्त संख्या प्राप्त कर रहा है। हाल ही में, कई समूहों ने क्रायो-ईएम के लिए माइक्रोपैटर्निंग ग्रिड के लिए प्रोटोकॉल विकसित किए हैं, जिसमें एक लाभ में सुधार डेटा संग्रह दक्षता 16,17,18 है। यहां प्राथमिक ड्रोसोफिला न्यूरॉन्स और सुसंस्कृत मानव सेल लाइनों (असंक्रमित या आरएसवी-संक्रमित) के क्रायो-ईटी अध्ययन के लिए माइक्रोपैटर्न टीईएम ग्रिड के लिए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माइक्रोपैटर्निंग सिस्टम का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। यह micropatterning प्रणाली बहुमुखी है और कई चरणों को अनुकूलित किया जा सकता है और विशिष्ट प्रयोगात्मक लक्ष्यों को फिट करने के लिए सिलवाया जा सकता है। TEM और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी अनुभव के साथ एक उपयोगकर्ता जल्दी से ग्रिड तैयारी और micropatterning में कुशल हो सकता है। सावधानीपूर्वक अभ्यास के साथ, कुछ पुनरावृत्तियों के बाद अच्छे परिणाम प्राप्त करने योग्य होने चाहिए। नीचे, उपलब्ध विकल्पों में से कुछ, उपयोगकर्ता विचार, संभावित लाभ, और क्रायो-ईएम के लिए माइक्रोपैटर्निंग के भविष्य के अनुप्रयोगों पर चर्चा की गई है।
पूरे सेल क्रायो-ईटी के लिए महत्वपूर्ण विचारों में से एक ईएम ग्रिड चयन है। ईएम ग्रिड दो भागों से बने होते हैं: एक जाल फ्रेम (या संरचनात्मक समर्थन) और पन्नी (या फिल्म), जो निरंतर या छेदी फिल्म सतह है जिस पर कोशिकाएं बढ़ेंगी। कॉपर मेश ग्रिड का उपयोग आमतौर पर प्रोटीन और पृथक परिसरों के क्रायो-ईएम के लिए किया जाता है। हालांकि, वे तांबे की साइटोटॉक्सिसिटी के कारण पूरे सेल क्रायो-ईटी के लिए अनुपयुक्त हैं। इसके बजाय, एक सोने की जाली आमतौर पर सेलुलर टोमोग्राफी के लिए उपयोग की जाती है। अन्य विकल्पों में निकल या टाइटेनियम शामिल हैं, जो सोने पर लाभ प्रदान कर सकते हैं जैसे कि बढ़ी हुई कठोरता 16। ईएम ग्रिड अनुप्रयोगों की एक श्रृंखला का समर्थन करने के लिए विभिन्न जाल आयामों के साथ उपलब्ध हैं। बड़े जाल आकार ग्रिड सलाखों और अधिक क्षेत्रों के बीच बढ़ने के लिए कोशिकाओं के लिए अधिक जगह प्रदान करते हैं जो झुकाव श्रृंखला संग्रह के लिए उपयुक्त हैं, हालांकि समग्र नमूना नाजुकता में वृद्धि की कीमत पर। सबसे अधिक इस्तेमाल की जाने वाली पन्नी छिद्रित या छेद अनाकार कार्बन है, जैसे कि क्वांटिफोल या सी-फ्लैट ग्रिड। जैविक लक्ष्यों को कार्बन में छेद के माध्यम से या इलेक्ट्रॉन-पारभासी कार्बन के माध्यम से चित्रित किया जा सकता है। R 2/1 या R 2/2 जैसे ग्रिड, जहां छेद 2 μm चौड़े होते हैं जो क्रमशः 1 और 2 μm के अलावा होते हैं, बड़ी संख्या में छेद प्रदान करते हैं और इस प्रकार डेटा संग्रह के लिए बड़ी संख्या में संभावित क्षेत्र प्रदान करते हैं। हालांकि, कुछ कोशिकाएं आर 1.2/20 ग्रिड या निरंतर कार्बन जैसी अधिक समान सतहों पर बेहतर तरीके से बढ़ सकती हैं और विस्तार कर सकती हैं। केंद्रित-आयन बीम मिलिंग (क्रायो-एफआईबी) द्वारा डाउनस्ट्रीम नमूना प्रसंस्करण के लिए, पन्नी को मिलिंग के माध्यम से हटा दिया जाता है, जिससे अंतर्निहित फिल्म की निरंतर उपस्थिति पर चिंताओं को कम किया जाता है। जाल के साथ के रूप में, अन्य सामग्रियों से पन्नियों भी उपलब्ध हैं, यहां प्रस्तुत पैटर्निंग प्रोटोकॉल के साथ SiO2 ग्रिड के लिए समान रूप से उपयुक्त है। आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले ग्रिड में पूरे सेल क्रायो-ईटी के लिए सोने के क्वांटिफोइल, निरंतर कार्बन, या SiO2 फिल्म 200-मेष ग्रिड (~ ग्रिड सलाखों के बीच 90 μm रिक्ति) शामिल हैं।
एक पैटर्न डिजाइन करते समय कई विचार हैं। इनमें से अधिकांश निर्णय प्रयोग के सेल प्रकार और उद्देश्य द्वारा निर्देशित होते हैं। एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु एक पैटर्न चुनना है जो संस्कृति में कोशिकाओं के आकार और आयामों का अनुमान लगाता है। कई अध्ययनों ने सेल विकास और साइटोस्केलेटल व्यवस्था 13,36,37 पर पैटर्न आकार के महत्वपूर्ण प्रभावों का प्रदर्शन किया है। पैटर्न डिजाइन के दौरान विशेष देखभाल की जानी चाहिए यदि यह ब्याज के लक्ष्य को बदल सकता है। प्रत्येक सेल प्रकार के लिए कई पैटर्न का परीक्षण यह निर्धारित करने के लिए किया गया था कि कौन से पैटर्न सेलुलर आसंजन और विकास को बढ़ावा देते हैं। माइक्रोपैटर्निंग सिस्टम का लचीलापन एक एकल ग्रिड पर कई पैटर्न के परीक्षण और एक ही प्रयोग के भीतर विभिन्न ग्रिड के लिए पैटर्न बदलने की अनुमति देता है। बड़े पैटर्न (~ 50-90 μm), जैसे कि यहां उपयोग किए जाने वाले, इस संभावना को बढ़ाते हैं कि कई कोशिकाएं पैटर्न के एक ही क्षेत्र का पालन करती हैं और आसंजन के बाद कोशिकाओं को विस्तारित करने और विस्तारित करने की अनुमति देती हैं। अधिक विवश पैटर्न (20-30 μm) प्रयोगों में उपयुक्त हो सकते हैं जहां सेल अलगाव सेल विस्तार की तुलना में अधिक महत्वपूर्ण है, जैसे कि केंद्रित-आयन बीम मिलिंग (क्रायो-एफआईबी) प्रयोगों के लिए। टोमोग्राफी अनुप्रयोगों के लिए, किसी को झुकाव-अक्ष के प्रभाव पर विचार करने की आवश्यकता हो सकती है। यदि एक पैटर्न को इस तरह से तैनात किया जाता है कि सभी कोशिकाएं एक ही दिशा में एक दूसरे के समानांतर बढ़ती हैं, तो यह संभव है कि माइक्रोस्कोप चरण पर लोड होने पर सभी कोशिकाएं झुकाव-अक्ष के लंबवत होंगी, जिसके परिणामस्वरूप डेटा की गुणवत्ता कम होगी।
अनपैटर्न किए गए ग्रिड पर, कोशिकाएं अक्सर ग्रिड सलाखों का पालन करती हैं, जहां उन्हें टीईएम द्वारा चित्रित नहीं किया जा सकता है। यहां तक कि पैटर्न वाले ग्रिड पर भी, कोशिकाओं को अक्सर ग्रिड वर्गों के कोनों में आंशिक रूप से पैटर्न वाले कार्बन पन्नी और ग्रिड बार दोनों पर तैनात किया जाता है। हाल ही में, माइक्रोपैटर्निंग का उपयोग जानबूझकर ग्रिड बार 18 पर सेल के हिस्से को स्थिति में रखने के लिए किया गया था। यह प्रयोगों के लिए माना जा सकता है जहां पन्नी पर पूरे सेल परिधि होना महत्वपूर्ण नहीं है। यह उन कोशिकाओं के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो सकता है जो एक ग्रिड वर्ग से बड़े हो सकते हैं, जैसे कि प्राथमिक न्यूरॉन्स कई दिनों में बढ़ते हैं।
ऐसे कई उपकरण हैं जिनका उपयोग पैटर्न डिजाइन करने के लिए किया जा सकता है। यहां, पैटर्न किसी भी आयाम में 800 पिक्सेल से कम तक सीमित था जैसे कि पैटर्न को किसी भी कोण पर घुमाया जा सकता है और अभी भी अधिकतम क्षेत्र के भीतर फिट किया जा सकता है जो इस माइक्रोपैटर्निंग सिस्टम द्वारा एकल प्रक्षेपण में पैटर्न कर सकता है। यह उपयोगकर्ता को माइक्रोस्कोप पर ग्रिड के अभिविन्यास की परवाह किए बिना ग्रिड के साथ ठीक से उन्मुख होने के लिए पैटर्न को घुमाने की अनुमति देता है। यहां, ग्रिड को छह पैटर्निंग क्षेत्रों में विभाजित किया गया था। मुख्य रूप से, यह ग्रिड के विभिन्न क्षेत्रों के बीच फोकस समायोजन की अनुमति देता है। गोल्ड ग्रिड, विशेष रूप से, बहुत निंदनीय हैं और ग्लास पर पूरी तरह से फ्लैट नहीं हो सकते हैं। साफ, परिष्कृत पैटर्निंग परिणामों के लिए उचित फोकस आवश्यक है। खंडित पैटर्न का उपयोग करके, पैटर्न की स्थिति में केवल मामूली समायोजन करने की आवश्यकता होती है यदि ग्रिड पैटर्निंग प्रक्रिया के दौरान थोड़ा बदल जाता है, हालांकि पीडीएमएस स्टेंसिल के साथ पीएलपीपी जेल का उपयोग करते समय यह आमतौर पर एक मुद्दा नहीं है। अंत में, ग्रिड के केंद्रीय चार ग्रिड वर्गों unpatterned रहे। यह एक उपयोगकर्ता को ग्रिड के केंद्र को स्पष्ट रूप से पहचानने में सक्षम होने का समर्थन करता है, जो कोरिलेटिव-इमेजिंग प्रयोगों के लिए बहुत उपयोगी है।
इस माइक्रोपैटर्निंग सिस्टम, लियोनार्डो के लिए पैटर्निंग सॉफ्टवेयर में सिलाई और पीडीएफ के रूप में पैटर्न आयात करने की क्षमता जैसी अधिक उन्नत विशेषताएं भी हैं, जो इस प्रोटोकॉल के दायरे से परे हैं। इस सॉफ़्टवेयर में microstructure का पता लगाने और स्वचालित पैटर्न पोजिशनिंग भी शामिल है जिसका उपयोग TEM ग्रिड पर किया जा सकता है। यह सुविधा सबसे उपयोगी है जब ग्रिड बहुत सपाट है और विभिन्न क्षेत्रों के बीच ध्यान समायोजित करने की आवश्यकता के बिना पैटर्न किया जा सकता है।
एक ईसीएम प्रोटीन के चयन का सेल आसंजन और विस्तार पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ सकता है। कुछ कोशिकाओं को शारीरिक परिवर्तनों से गुजरने के लिए जाना जाता है जब विशिष्ट सब्सट्रेट्स 38 पर उगाया जाता है। साहित्य में रिपोर्ट किए गए पूर्व कार्य के आधार पर किसी भी नए सेल प्रकार के लिए एकाधिक ईसीएम प्रोटीन और सांद्रता का परीक्षण किया गया था। लैमिनिन, फाइब्रिनोजेन, फाइब्रोनेक्टिन और कोलेजन व्यापक रूप से सुसंस्कृत कोशिकाओं के लिए उपयोग किए जाते हैं और यदि अन्य डेटा उपलब्ध नहीं है तो इसे प्रारंभिक बिंदु के रूप में उपयोग किया जा सकता है। हालांकि, अन्य ईसीएम प्रोटीन पर भी विचार किया जाना चाहिए यदि आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले ईसीएम प्रोटीन कोशिकाओं के लिए उचित अनुपालन गुण प्रदान करने में विफल रहते हैं। यह प्राथमिक ड्रोसोफिला न्यूरॉन्स के लिए विशेष रूप से सच था, क्योंकि उचित सेलुलर पालन के लिए पौधे के लेक्टिन कोकानावलिन ए की उच्च सांद्रता आवश्यक थी। ईसीएम के साथ सेलुलर आसंजन और विकास की संगतता का परीक्षण टीईएम ग्रिड में संक्रमण से पहले ग्लास डिश या स्लाइड पर पैटर्निंग द्वारा किया जा सकता है। यह पूर्व-स्क्रीनिंग दृष्टिकोण समय और लागत प्रभावी है यदि बड़ी संख्या में संयोजनों की जांच करने की आवश्यकता है। एक फ्लोरोसेंट रूप से संयुग्मित ईसीएम प्रोटीन का समावेश पैटर्निंग की सफलता और गुणवत्ता का आकलन करने के लिए मूल्यवान है।
सेल सीडिंग पूरे सेल क्रायो-ईटी के लिए सबसे महत्वपूर्ण चरणों में से एक है, या तो माइक्रोपैटर्निंग 6,16,39 के साथ या बिना। प्राथमिक ड्रोसोफिला या अन्य न्यूरॉन्स के लिए, जो नाजुक हैं, निलंबन में अस्थिर हैं, और मात्रा में सीमित हो सकते हैं, एकल सीडिंग दृष्टिकोण को मॉनिटर, अनुक्रमिक सेल सीडिंग पर पसंद किया जाता है। एक अनुकूलित सेल घनत्व पर एक एकल सीडिंग चरण, जैसा कि ड्रोसोफिला न्यूरॉन्स के लिए प्रोटोकॉल में वर्णित है, अधिकांश सेल प्रकारों के लिए एक व्यवहार्य विकल्प है। हालांकि, कम प्रारंभिक एकाग्रता पर सब्सट्रेट पर कोशिकाओं को बीज करना और यहां और अन्य साहित्य 18 में वर्णित के रूप में एक निगरानी फैशन में अधिक कोशिकाओं को जोड़ना भी संभव है। यह अनुक्रमिक सीडिंग कुछ मामलों में अधिक सुसंगत परिणाम प्रदान कर सकती है। मानक सेल संस्कृति के समान, सेल व्यवहार्यता को बनाए रखने और अलगाव के दौरान सेल क्लम्पिंग को कम करने के लिए हमेशा देखभाल की जानी चाहिए।
जब पहली बार माइक्रोपैटर्निंग के साथ शुरू होता है, तो कुछ संभावित नुकसान होते हैं जो अंतिम परिणाम के लिए हानिकारक होते हैं। सावधानीपूर्वक ग्रिड हैंडलिंग और बाँझ तकनीक, PLPP जेल का एक समान वितरण, पैटर्निंग के दौरान उचित खुराक और ध्यान केंद्रित करना, और सीडिंग से पहले सेल व्यवहार्यता का रखरखाव सफलता के लिए सबसे महत्वपूर्ण विचारों में से एक है। कुछ संभावित मुद्दों के साथ-साथ समाधानों की एक सूची तालिका 1 में एकत्र की गई थी।
माइक्रोपैटर्न्ड ग्रिड का उपयोग ग्रिड में एक सुसंगत सेल घनत्व स्थापित करने के लिए कोशिकाओं की स्थिति में मदद करने के लिए और झुकाव-श्रृंखला संग्रह 16,18 के लिए उपयुक्त क्षेत्रों में रुचि के क्षेत्रों की स्थिति में मदद करने के लिए किया जा सकता है। कोशिकाओं के प्लेसमेंट और स्थिति का उपयोग क्रायो-सीएलईएम प्रयोगों में सहसंबंध के लिए फिड्यूशियल मार्करों के रूप में किया जा सकता है, जिससे नाजुक खोजक-ग्रिड और फ्लोरोसेंट फिड्यूशियल मार्करों की आवश्यकता कम हो जाती है। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इस तरह के fiducial मार्कर अभी भी उप-माइक्रोमीटर सटीकता सहसंबंध 29,40 के लिए उपयोगी हो सकते हैं। इसके अलावा, अलग-अलग कोशिकाओं का एक समान वितरण भी केंद्रित-आयन बीम मिलिंग (क्रायो-एफआईबी) प्रयोगों के लिए अत्यधिक फायदेमंद है ताकि कोशिकाओं की संख्या को अधिकतम किया जा सके, जिसमें से लामेला को काटा जा सकता है।
क्रायो-ईएम वर्कफ़्लोज़ में माइक्रोपैटर्निंग के अतिरिक्त डेटा थ्रूपुट में औसत दर्जे के सुधार के परिणामस्वरूप और संभावित रूप से नए प्रयोगों को सक्षम किया जाएगा। जैसा कि तकनीक को आगे अपनाया और विकसित किया गया है, ईसीएम ग्रेडिएंट, कई ईसीएम जमाव, और माइक्रोस्ट्रक्चर असेंबली सहित माइक्रोपैटर्निंग के अधिक उन्नत अनुप्रयोग पूर्ण सेलुलर संदर्भ में जैविक लक्ष्यों और प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए क्रायो-ईटी की क्षमताओं का विस्तार करेंगे।
The authors have nothing to disclose.
हम डॉ जिल Wildonger, डॉ Sihui Z. यांग, और श्रीमती जोसेफिन डब्ल्यू मिशेल जैव रसायन विभाग में धन्यवाद, विस्कॉन्सिन विश्वविद्यालय, मैडिसन उदारता से elav-Gal4, UAS-CD8 साझा करने के लिए: GFP मक्खी तनाव (Bloomington स्टॉक सेंटर, # 5146). हम इस परियोजना के दौरान अपने उदार समर्थन के लिए डॉ Aurélien Duboin, श्री लॉरेंट Siquier, और सुश्री मैरी-शार्लोट मानुस Alvéole से और श्री सर्गे Kaddoura Nanoscale लैब्स से धन्यवाद करना चाहते हैं। इस काम को विस्कॉन्सिन विश्वविद्यालय, मैडिसन, विस्कॉन्सिन विश्वविद्यालय, मैडिसन में जैव रसायन विभाग द्वारा भाग में समर्थित किया गया था, और सार्वजनिक स्वास्थ्य सेवा अनुदान R01 GM114561, R01 GM104540, R01 GM104540-03W1, और U24 GM139168 को E.R.W. और R01 AI150475 को P.W.S. NIH से। इस शोध का एक हिस्सा एनआईएच अनुदान U24 GM129547 द्वारा समर्थित था और OHSU में PNCC में प्रदर्शन किया गया था और EMSL (grid.436923.9) के माध्यम से एक्सेस किया गया था, जैविक और पर्यावरण अनुसंधान कार्यालय द्वारा प्रायोजित विज्ञान उपयोगकर्ता सुविधा का एक डीओई कार्यालय। हम विस्कॉन्सिन विश्वविद्यालय, मैडिसन में जैव रसायन विभाग में क्रायो-ईएम रिसर्च सेंटर में सुविधाओं और इंस्ट्रूमेंटेशन के उपयोग के लिए भी आभारी हैं।
0.1% (w/v) Poly-L-Lysine | Sigma | P8920-100ML | |
0.22 µm syringe filters PVDF membrane | Genesee | 25-240 | |
22×60-1 Glass cover slip | Fisher | 12545F | |
5/15 Tweezers | EMS (Dumont) | 0203-5/15-PO | |
Antibiotic-Antimycotic (100X) | ThermoFisher (Gibco) | 15240096 | |
BEAS-2B cells | ATCC | CRL-9609 | |
Collagen I, bovine | ThermoFisher (Gibco) | A1064401 | |
Concanavalin A, Alexa Fluor 350 Conjugate | ThermoFisher (Invitrogen) | C11254 | |
DMEM | Fisher (Lonza) | BW12-604F | |
EtOH | Fisher (Decon Labs) | 22-032-600 | |
Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | |
Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 647 Conjugate | ThermoFisher (Invitrogen) | F35200 | |
Fibronectin Bovine Protein, Plasma | ThermoFisher (Gibco) | 33010018 | |
Glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
Glucose | VWR | 0643-1KG | |
Grid prep holder | EMS | 71175-01 | |
HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
Hemacytometer | Fisher (SKC, Inc.) | 22600100 | |
HEPES | Fisher (ACROS Organics) | AC172572500 | |
Hoechst 33342 | ThermoFisher (Invitrogen) | H3570 | |
Insulin | Fisher (Sigma Aldrich) | NC0520015 | |
KCl | MP Bio | 194844 | |
KH2PO4 | Fisher (ACROS Organics) | AC212595000 | |
Leica-DMi8 | Leica Microsystems | Can be customized with camera, stage, and objective attachments | |
Leonardo | Alvéole | https://www.alveolelab.com/our-products/leonardo-photopatterning-software/ | |
Liberase Research Grade | Fisher (Supply Solutions) | 50-100-3280 | |
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | ThermoFisher (Invitrogen) | L3224 | |
Microscope camera | Hammamatsu | C13440-20CU | |
Motorized stage | Märzhäuser Wetzlar | 00-24-599-0000 | |
NaCl | Fisher (Fisher BioReagents) | BP358-1 | |
NaH2PO4 | Fisher (ACROS Organics) | AC207802500 | |
NaOH | Fisher (Alfa Aesar) | AAA1603736 | |
PBS | Corning | 21-040-CV | |
PDMS stencils | nanoscaleLABS | PDMS_STENCILS_EM | https://www.alveolelab.com/our-products/pdms-stencil-multiwell-plate/ |
PEG-SVA | nanoscaleLABS | PEG-SVA-1GR | mPEG-Succinimidyl Valerate, MW 5,000 |
Penicillin | Fisher (Research Products International Corp) | 50-213-641 | |
pH strips | Fisher (Millipore Sigma) | M1095350001 | pH probe can also be used |
PLPP gel | nanoscaleLABS | PLPP-GEL-300UL | https://www.alveolelab.com/our-products/plpp-photoactivatable-reagent/ |
PRIMO | Alvéole | https://www.alveolelab.com/our-products/primo-micropatterning/ | |
pSynkRSV-I19F (BAC containing RSV A2-mK+ antigenomic cDNA ) | BEI Resources | NR-36460 | https://www.beiresources.org/Catalog/BEIPlasmidVectors/NR-36460.aspx |
Quantifoil grids | EMS (Quantifoil) | Q2100AR1 | 2 µm holes spaced 1 µm apart, other dimensions are available |
RPMI | Fisher (Lonza) | BW12-702F | |
RSV A2-mK+ | see entry for pSynkRSV-19F | – | Described in Hotard et al. [22]. Can be generated from pSynkRSV-ll9F |
Schneider's Media | ThermoFisher (Gibco) | 21720-024 | |
SerialEM | SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ ) | https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | |
Straight tweezers | EMS (Dumont) | 72812-D | |
Streptomycin | Fisher (Fisher BioReagents) | BP910-50 | |
Sucrose | Avantor | 4097-04 | |
Tetracycline | Sigma | T8032-10MG | |
Titan Krios electron microscope | ThermoFisher | 300kV, with direct electron detector camera and energy filter | |
Trypsin | ThermoFisher (Gibco) | 15090046 | |
Tube Revolver/Rotator | Fisher (Thermo Scientific) | 11676341 | |
UAS:mcD8:GFP Drosophila fly strain | Bloomington Drosophila Stock Center | 5146 | http://flybase.org/reports/FBtp0002652.html |