Følgende protokol beskriver udviklingen og optimeringen af en arbejdsgang med høj kapacitet til ormedyrkning, fluorescensbilleddannelse og automatiseret billedbehandling for at kvantificere polyglutaminaggregater som en vurdering af ændringer i proteostase.
En stigning i forekomsten af neurodegenerative proteinkonformationssygdomme (PCD’er) har skabt stor interesse for dette emne gennem årene. Denne øgede opmærksomhed har krævet diversificering og forbedring af dyremodeller, der er i stand til at reproducere sygdomsfænotyper observeret hos mennesker med PCD’er. Selvom murine-modeller har vist sig uvurderlige, er de dyre og er forbundet med besværlige metoder med lav kapacitet. Brug af Caenorhabditis elegans nematodemodellen til undersøgelse af PCD’er er blevet begrundet i dens relative lette vedligeholdelse, lave omkostninger og hurtige generationstid, hvilket giver mulighed for applikationer med høj kapacitet. Derudover gør høj bevarelse mellem C. elegans og humane genomer denne model til et uvurderligt opdagelsesværktøj. Nematoder, der udtrykker fluorescerende mærkede vævsspecifikke polyglutamin (polyQ) kanaler udviser alders- og polyQ-længdeafhængig aggregering karakteriseret ved fluorescerende foci. Sådanne journalister anvendes ofte som proxyer til at overvåge ændringer i proteostase på tværs af væv. Manuel aggregeret kvantificering er tidskrævende og begrænser eksperimentel gennemstrømning. Desuden kan manuel focikvantificering introducere bias, da aggregeret identifikation kan være meget subjektiv. Heri blev en protokol bestående af ormedyrkning, billedoptagelse og databehandling standardiseret til at understøtte aggregeret kvantificering med høj kapacitet ved hjælp af C. elegans , der udtrykker tarmspecifik polyQ. Ved at implementere en C. elegans-baseret billedbehandlingspipeline ved hjælp af CellProfiler, en billedanalysesoftware, er denne metode optimeret til at adskille og identificere individuelle orme og opregne deres respektive aggregater. Selvom begrebet automatisering ikke er helt unikt, er behovet for at standardisere sådanne procedurer for reproducerbarhed, eliminering af bias fra manuel tælling og øge gennemstrømningen høj. Det forventes, at disse metoder drastisk kan forenkle screeningsprocessen for store bakterielle, genomiske eller lægemiddelbiblioteker ved hjælp af C. elegans-modellen .
Aldersafhængige neurodegenerative proteinkonformationssygdomme (PCD’er) såsom Alzheimers, Parkinsons og Huntingtons sygdomme eller amyotrofisk lateral sklerose er kendetegnet ved proteinfejlfoldning, der fører til aggregering, celledød og vævsdegeneration1. Mens protein misfolding anerkendes som synderen, er etiologien af disse sygdomme ikke klar. Som sådan er udviklingen af effektive terapier blevet hindret af manglende viden om de faktorer og tilstande, der bidrager til sygdomsdebut og progression. Nylige undersøgelser tyder på, at ændringer i mikrobiomet påvirker begyndelsen, progressionen og sværhedsgraden af PCD’er 2,3,4. Kompleksiteten af det menneskelige eller endda murinmikrobiom gør det imidlertid vanskeligt at gennemføre undersøgelser, der ville afsløre mikrobernes nøjagtige indflydelse på deres vært. Derfor bruges enklere organismer, såsom Caenorhabditis elegans, ofte som et opdagelsesværktøj 5,6,7,8. Nylige undersøgelser har anvendt C. elegans til at undersøge virkningen af bakterier på værtsproteostase og sygdomspatogenese 9,10. Bakteriel kolonisering, hormese og genomiske ændringer er blandt eksemplariske tilstande, der påvirker aggregeringen af polyglutamin (polyQ) kanaler 9,11,12. Derudover udviser disse misfoldede proteinklynger polyQ-længde- og aldersafhængig akkumulering inden for værten og er forbundet med nedsat bevægelighed 9,13. Den relativt enkle tilgang til kvantificering af fluorescerende mærket puncta kan generere vigtige data om forhold, faktorer eller lægemidler, der påvirker proteinfoldning og aggregering.
Selvom kvantificering af fluorescerende puncta har vist sig at være en pålidelig og relativt enkel procedure, er udfordringen fortsat at udvikle en protokol, der letter storstilet screening af forbindelser, bakterier eller tilstande, der påvirker proteinaggregering. Begrebet automatiseret C. elegans billedbehandling og punktkvantificering er ikke helt nyt, da der er udviklet en række praktiske støtteværktøjer 14,15. Integrationen af dyrkning, billedoptagelse og en behandlingspipeline er imidlertid afgørende for at eliminere variation i resultater og give mulighed for skærme med højere kapacitet.
Som sådan er hensigten med dette manuskript at standardisere den procedure, der anvendes til at kvantificere polyQ-aggregering i C. elegans som en proxy til påvisning af ændringer i proteostase. Denne opgave blev udført ved at anvende CellProfiler, en open source billedanalysesoftware16 , der er i stand til automatiseret orm og aggregeret identifikation, og er integreret i en større protokol til dyrkning af orme, erhvervelse af billeder og behandling af data.
Den beskrevne protokol skitserer procedurer for C. elegans dyrkning, billeddannelse og billedbehandling, der inkorporerer CellProfiler, en open source billedanalysesoftware. De repræsentative resultater viser reproducerbarhed, reduktion af bias og skalerbarhed. Denne standardiserede procedure vil forbedre screeningsstrategier, der anvendes med store bakterielle, genomiske eller lægemiddelbiblioteker. Mens der findes andre automatiserede C. elegans-metoder til objektdetektion, tilbyder den beskrevne teknik en standardiseret pipeline med højere kapacitet, der integrerer dyrkning, billedoptagelse og analyse.
Flere variationer af ormedyrkning måtte testes for at optimere protokollen beskrevet heri. Oprindeligt blev orme overført til prøvebakterier umiddelbart efter alderssynkronisering (L1-trin). En sådan tilgang resulterede imidlertid i en population af orme med varierende størrelser, selv blandt orme inden for samme brønd. C. eleganer er kendt for patogenundgåelse19, hvilket kunne have bidraget til den observerede variation i størrelse og i sidste ende påvirke downstream imaging-ormdetektion, især. For at eliminere en sådan variabilitet blev hele NGM-området i hver brønd dækket af testbakterier. Desuden blev orme fodret med E. coli OP50 og fik lov til fuldt ud at udvikle sig til unge voksne i 48 timer ved 25 °C. At tillade orme at nå voksenalderen på E. coli OP50, før de overføres til testbakterier, resulterede i mere ensartet kropsstørrelse. Derudover blev overbelægning og hurtig udtømning af mad af afkom elimineret ved at supplere NGM-agar med FUDR. Implementeringen af FUDR fjernede afkom og forbedrede automatiseret ormidentifikation, som blev skjult af afkom, der blandede sig med forældrepopulationen. Det er dog vigtigt at være forsigtig og anvende passende kontroller, når du bruger FUDR, da forbindelsen vides at påvirke C. elegans proteostase og levetid20,21. Under de betingelser, der er beskrevet i denne protokol, påvirkede FUDR ikke intestinal polyQ-aggregering (supplerende figur 5); derfor var dens anvendelse egnet og gavnlig for den beskrevne metode.
Frysning af prøver før billeddannelse viste sig at være et kritisk skridt i den vellykkede anvendelse af rørledningen. De samlede tællinger før frysning var signifikant højere end manuelle tællinger (figur 3B). At holde orme ved -20 °C i 18-48 timer før billeddannelse reducerede baggrundsfluorescens og i sidste ende forbedret samlet detektion (figur 3A). Virkningerne af frysning på aggregeret detektion er kun blevet undersøgt for polyQ og bør ikke generaliseres til andre modeller uden yderligere undersøgelse af sådanne virkninger.
På trods af at alle betingelserne blev holdt de samme, blev det observeret, at det gennemsnitlige antal aggregater pr. orm kunne variere mellem forskellige kørsler, mens forholdet mellem antallet af aggregater hos dyr koloniseret med OP50 versus MPAO1 forblev konsistent (figur 6, supplerende figur 2, supplerende figur 5). Det er derfor vigtigt altid at medtage E. coli OP50-kontrol eller yderligere passende referencekontroller i alle løb. En sådan variation i de samlede tal mellem forsøg kan påvirkes af miljøforhold (temperatur, fugtighed)22,23 eller genetisk baggrund8. Faktisk blev det observeret, at tarmfluorescens efter langvarig kultur faldt drastisk eller var helt tabt, hvilket krævede optøning af en ny stamme fra frossen bestand. Det observerede fald i fluorescens kan være et resultat af genetiske ændringer, der undertrykker giftige transgener, såsom dem, der udtrykker polyQ. Ikke desto mindre understreger den ekstraordinære reproducerbarhed af de observerede resultater mellem forskellige eksperimenter (supplerende figur 2), mellem biologiske replikater (figur 5) og inden for samme prøve (supplerende figur 3) styrken af denne tilgang.
Talrige rapporter har anvendt intestinal polyQ til at studere proteostase 9,11,12,13,24,25. En direkte sammenligning mellem resultaterne kan imidlertid ikke foretages på grund af variabilitet mellem eksperimentelle tilgange og udlæsningsmetoder. Ikke desto mindre rekapituleres nogle få resultater fra tidligere offentliggjorte data ved den automatiserede kvantificering, der er beskrevet heri, herunder bakteriel induktion af aggregering 9,13 og et sammenligneligt antal aggregater11. Samlet set tilbyder den beskrevne rørledning et værdifuldt værktøj til at studere proteostase.
Den metode, der er beskrevet heri, har nogle iboende udfordringer. For eksempel kræver det tilstrækkelig tid til at mestre alle komponenter i denne protokol, hvilket især gælder for afsnit 8 i protokollen, hvilket kræver kendskab til analysen for at afgøre, om de erhvervede billeder er egnede til rørledningsanalyse. Afvigelser fra de billedoptagelsesindstillinger, der bruges i denne protokol, er mulige; dog vil ændring af indstillingerne og ormtræningssættet sandsynligvis være påkrævet. Denne rørledning kan skelne mellem aggregater i forskellige størrelser og dem, der rører ved, hvilket begrænser “blanding” af aggregater og i sidste ende øger detektionsfølsomheden. Der kan dog opstå problemer, når man forsøger at identificere store aggregater, der overskrider det accepterede størrelsesinterval, da en udvidelse af den øvre størrelsestærskel kan føre til fejl forårsaget af dårlig identifikation, f.eks. manglende evne til at skelne mellem aggregater, der rører ved hinanden. En balance mellem nøjagtighed, størrelse og intensitet skal findes inden billedanalyse. Effektiviteten af aggregeret identifikation kan forbedres yderligere ved at inkorporere maskinindlæring for at skabe et neuralt netværk, der er i stand til at forbedre aggregeret detektion. Sådanne forbedringer undersøges i øjeblikket og vil i høj grad hjælpe med at løse aktuelle problemer såsom påvisning af aggregater, der ligger på forskellige fokusplaner, eller som har unormale former.
En bemærkelsesværdig svaghed ved den beskrevne metode er variationen i automatiserede aggregerede tællinger, da de ikke altid rekapituleres ved manuelle tællinger i orme fodret med forskellige bakteriestammer. For eksempel, baseret på automatiserede tællinger, havde orme fodret med P. aeruginosa mutant 53 (M53) signifikant færre aggregater sammenlignet med vildtypestammen (MPAO1) (figur 7); Bekræftelsen af hittet viste imidlertid ingen signifikant forskel (supplerende figur 4). Generelt har lægemiddelskærme med høj kapacitet en høj grad af falsk-positiv hitdetektion, og den beskrevne metode er ingen undtagelse26. Det er således en kritisk del af protokollen at bekræfte alle potentielle hits.
Mens denne protokol blev optimeret til at passe til en screeningsstrategi for at identificere bakterier, der påvirker værtsproteostase, kan hvert trin ændres yderligere for at teste effekten af genomiske RNAi-biblioteker, små molekyler eller andre tilstande. Yderligere ændringer kan foretages på hvert trin for at passe til kravene i en specifik screeningstrategi. Desuden giver denne teknik et niveau af fleksibilitet, der giver mulighed for optimering af hvert trin, så det passer til en bestemt model. For eksempel kan denne tilgang udvides til polyQ-aggregering i andre væv eller ekstraktion af andre funktioner, der er påvist i billeder, såsom overvågning af genekspression ved hjælp af inducerbare fluorescerende reportere (f.eks. Varmechokgener), vurdering af subcellulær lokalisering af proteiner (f.eks. Nuklear lokalisering af DAF-16), undersøgelse af aggregering i andre sygdomsmodeller (Aβ1-42, α-synuclein, TDP-43 osv.) eller vurdering af fysiologiske fænotyper, såsom ormstørrelse.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (1RO3AG069056-01) og Infectious Diseases Society of America finansiering til DMC. Finansieringskilderne havde ingen rolle i undersøgelsesdesign, dataindsamling og analyse, beslutning om at offentliggøre eller udarbejdelse af manuskriptet. Vi takker medlemmerne af Czyz Lab for korrekturlæsning af manuskriptet. Tegneseriefigurer blev genereret ved hjælp af BioRender betalt licens.
1.7 mL Microtubes | Olympus Plastics | Cat#24-282 | Microcentrifuge tubes |
10 mL Serological Pipettes | GenClone | Cat#12-104 | Plastic pipettes |
15 mL Centrifuge Tubes, Racked | Olympus Plastics | Cat#28-101 | Conical tubes |
5-Fluoro-2′-deoxyuridine | Fisher Scientific | D2235100MG | FUDR |
Accu-jet Pro Pipette Controller | Genesee Scientific | 91-600RB | Pipette gun |
Agar | Fisher Scientific | Cat#BP1423-2 | Granulated agar |
BioRender | BioRender | Graphical figure generator | |
Bleach (Regular) | Clorox | Bar# 044600324111, Splash-less Bleach | 4.5% sodium hypochlorite |
C. elegans: AM140: rmIs132 [unc-54p::q35::yfp] | Morimoto Lab (Northwestern University) | AM140, Q35::YFP | Muscle polyQ |
C. elegans: AM738: rmIs297[vha-6p::q44::yfp; rol-6(su1006)] | Morimoto Lab (Northwestern University) | AM738, Q44::YFP | Intestinal polyQ |
CaCl2·2H2O | Fisher Scientific | Cat#C79-500 | Calcium chloride dihydrate |
CellProfiler | Broad Institute | Image analysis software | |
Cholesterol | Fisher Scientific | Cat#ICN10138201 | Cholesterol |
Circulating Water Bath Head | Lauda | 26LE | Lauda E 100 |
CoolLED pE300lite 365 dir mount STEREO | CoolLED | 8114931 | Fluorescent light control and emitter |
16 mL Culture Tubes | Olympus Plastics | 21-129 | Culture tubes, 17 mm x 100 mm |
Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | E. coli control strain |
Ethanol, 200 Proof | Decon Labs, Inc. | 2701 | |
Eyepiece 10x/23B, adjustable, 3d gen | Leica Microsystems | 10450910 | Eyepiece set |
Filter Set ET GFP – MZ10F | Leica Microsystems | 10450588 | Filter cube |
GraphPad Prism v9.2.0 | GraphPad Software, Inc. | Statistical analysis tool | |
Heratherm Incubator IMP180 | Thermo | 51031562 | Refrigerated incubator |
Innova 4000 | New Brunswick Scientific | M1192-0000 | Shaking incubator |
K5 Camera | Leica Microsystems | 11547112 | Stereomicroscope camera |
KH2P04 | Fisher Scientific | Cat#P285-3 | Potassium phosphate monobasic |
LAS X Imaging Software | Leica Microsystems | Microscope imaging software | |
Leica MZ10 F Optics Carrier | Leica Microsystems | 10450103 | Stereomicroscope |
Levamisole | Fisher Scientific | Cat#0215522805 | Levamisole hydrochloride |
Luria Broth (Lennox) | Apex Bioresearch Products | Cat#11-125 | LB |
Magnetic Stir Plate | Fisher Scientific | 11-100-49S | Stir plate |
MgSO4·7H2O | Alfa Aesar | A14491 | Magnesium sulfate heptahydrate |
Microscope Slides | Premiere | 8205 | Single frosted microscope slides |
Na2HPO4·7H2O | Fisher Scientific | Cat#S373-500 | Sodium phosphate dibasic heptahydrate |
NaCl | Fisher Scientific | Cat#S671-500 | Sodium chloride |
NaOH | Fisher Scientific | Cat#S318-3 | Sodium hydroxide pellets |
Objective Achromat, f = 100 mm | Leica Microsystems | 10411597 | Objective microscope lens |
Petri Dishes | Genesee Scientific | Cat#32-107G | 100 mm x 15 mm |
Pseudomonas aeruginosa Mutant Library | Manoil Lab (University of Washington) | P. aeruginosa mutant library | |
Suspension Culture Plate 24-Well, Flat Bottom | Olympus Plastics | 25-102 | Used for worm growth and imaging |
Trinocular Tube 100% M-series | Leica Microsystems | 10450043 | |
Trypticase Peptone | ThermoFisher, Difco | Cat#211921 | |
TX-400 Rotor | Thermo Scientific | Cat#75003181 | Swing bucket rotor |
Vacuum Driven Filter System | GenClone | Cat#25-227 | 500 mL, PES Membrane, .22 µm |
Video Objective with C-Mount | Leica Microsystems | 10447367 | 0.63x camera adapter tube |