Här beskriver vi en visualisering och kvantifieringsmetod för murin hind-limb fartyg med hjälp av mikro-röntgen datortomografi.
Blodkärl är komplexa nätverk med trädliknande strukturer, och kärlnätverk är nödvändiga för att upprätthålla både cirkulation och upprätthålla organfunktion. Att klargöra mekanismen för blodkärlsbildning är därför extremt användbart för att klargöra utvecklingsprocesser och patologiska mekanismer. Murine hind-limb fartyg används ofta som en modell för fysiologiska och patologiska angiogenes. Utvärderingen utförs huvudsakligen via en tvådimensionell metod med hjälp av vävnadssektioner. Metoderna för att utvärdera tredimensionell (3D) vaskulär morfologi är dock särskilt begränsade. Detta dokument introducerar en metod för att visualisera murin bakben med hjälp av datortomografi (CT). Strålningsoläsk harts injiceras genom den fallande aortan, och hela kärl är fyllda med färgämne. Genom att justera tidpunkten för färginjektion är arteriell-specifik fyllning också möjlig, och prover kan erhållas med alla mikroröntgen CT-enheter. Denna kontrastmetod ger en grundläggande teknik för 3D-utvärdering av murin blodkärl i de nedre extremiteterna. Dessutom kan denna metod användas för att visualisera alla blodkärl under membranet och utvärdera blodkärl i bukorganen.
Blodkärl är komplexa nätverk med trädliknande strukturer. Angiogenes och ny kärlbildning spelar viktiga roller i upprätthållandet av organhomeostas1. Angiogenes regleras för behandling av ischemiska och maligna sjukdomar2. Det är därför viktigt att förstå de underliggande mekanismerna för angiogenes. Murin bakbenskärl används ofta som en användbar modell för kärlforskning3; ligatur av iliaca eller femorala gatan är en känd hind-limb ischemia modell som används för att bedöma angiogenes och vaskulär ombyggnad i fysiologiska och patologiska angiogenesis4. Utvärderingen av angiogenes utförs dock huvudsakligen genom avsnitt färgning, och metoder för att utvärdera 3D vaskulär morfologi är särskilt begränsade.
Jämfört med sektionsfärgning möjliggör CT 3D-visualisering. Nyligen rapporterade Weyers et al. ett sofistikerat protokoll som är lämpligt för CT imaging, vilket möjliggör visualisering av murine vuxna födans cirkulationssystem5. Vi modifierade deras metod för att skapa en provberedningsmetod lämplig för CT-avbildning av de nedre extremiteterna blodkärlen6. Här injiceras ett strålningsoläskharts genom den fallande aortan, och kärlen i de nedre extremiteterna fylls med färgämne. Genom att justera tidpunkten för färginjektion är arteriell-specifik fyllning också möjlig, och prover kan erhållas med alla mikro-röntgen datortomografi enheter. Denna kontrastmetod ger en grundläggande teknik för 3D-utvärdering av murin blodkärl under membranet och i bukorganen och de nedre extremiteterna.
Denna rapport introducerar en sofistikerad metod för att visualisera blodkärl i underkroppen. Det finns flera kritiska steg i denna process: den första är preperfusion före injektionen av kontrastmedium. Om tillräckligt med blod inte avlägsnas kommer kontrasten inte att fylla systemet. Dessutom stör införandet av luftbubblor fyllningen av kontrasten; Luften i kretsen måste därför avlägsnas helt. Eftersom kontrastmediet inte stelnar omedelbart efter injektionen bör provet inte flyttas i alltför hög utsträckning.
Denna metod är användbar för att utvärdera den ökade bildandet av blodkärl och cirkulation, såsom oavsiktlig cirkulation. Omvänt, som en begränsning, är det svårt att utvärdera smala blodkärl, eftersom det är svårt att skilja mellan stenos och en konstgjord minskning av kontrastmediet. Dessutom är det utmanande att utvärdera blodkärl i ben, eftersom separationen av blod och ben är svår.
En alternativ metod för 3D-visualisering är immunstaining. Med hjälp av vävnadsrensningstekniken finns flera metoder tillgängliga för 3D-avbildning7. Immunostaining är fördelaktigt eftersom det möjliggör färgning av specifika proteiner med hjälp av antikroppar. En färsk rapport utmanar helkroppstomografi baserat på immunostaining8; CT-baserad avbildning kräver dock ingen vävnadsrensning.
Denna metod möjliggör visualisering av alla kärl under membranet, inklusive bukorganen. Angiogenes i bukorganen har en stark inverkan på att upprätthålla homeostas och utveckla sjukdomar9,10. Eftersom detta protokoll optimerades för utvärdering av de nedre extremitetskärlen, skulle organ-specifika priming möjliggöra visualisering av angiogenes associeras med någon faktor, såsom inflammation eller tumörer.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Yasuyo Kimura, Megumi Nagahiro och Saeko Tokunaga för det utmärkta tekniska stödet i djurförsök.
1 mL syringe | TERUMO | SS-01T | |
10% Formalin Solution | Fujifilm-Wako | 068-03841 | |
10x phosphate-buffered saline (-) (PBS) | Fujifilm-Wako | 163-25265 | Prepare 1x PBS |
22 G catheter (22 G S5 x 1" V(F)) | MEDIKIT | HP2140 | Only catheter is used. |
23 G needle | TERUMO | NN-2325R | Use as a pin |
4% paraformaldehyde in PBS | Fujifilm-Wako | 163-20145 | |
5 mL syringe | |||
5-0 Suture with needle | Alfresa Pharma Corporation | ER1205SB45 | |
Adenosine | Sigma-aldrich | A9251-5G | For vasodilating solution |
Dumont #55 Forceps | FST | No.11255-20 | |
Extension tube | TOP | X2-FL50 | |
Falcon 50 mL tube | CORNING | 352098 | |
Graefe Forceps | FST | No.11051-10 | |
Heparin Sodium 5,000 units/5 mL | Mochida Co. Ltd. | 224122458 | |
Isoflurane | Fujifilm-Wako | 099-06571 | |
Microfil Injection Compounds | Flow Tech Inc. | MV-117 | Mix liquid MV-Compound (stain) and MV-Diluent 1: 1 |
Papaverine hydrochloride | Fujifilm | 164-18002 | For vasodilating solution |
Small Animal Anesthetizer | Muromachi Kikai Co. Ltd. | MK-A100ecoW-ST | |
Spring Scissors – Angled to Side | FST | No.15006-09 | |
Surgical Scissors – Sharp-Blunt | FST | No.14001-12 | |
three-way cock | TERUMO | TS-TR1K | |
Transfer pipette | SAMCO SCIENTIFIC | SM262-1S | Use for mixing contrast medium |
X-ray CT scanner | Toshiba IT & Control Systems Corporation | TOSHIBA TOSCANNER 32300 FPD |