Dit protocol beschrijft een verbeterde methode voor het synthetiseren van hoge opbrengsten van recombinante eiwitten uit een Streptomyces venezuelae celvrije transcriptie-translatie (TX-TL) systeem.
Streptomyces spp. zijn een belangrijke bron van klinische antibiotica en industriële chemicaliën. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 is een snelgroeiende soort en een natuurlijke producent van chlooramfenicol, jadomycine en pikromycine, waardoor het een aantrekkelijke kandidaat is als een chassis voor synthetische biologie van de volgende generatie. Daarom zijn genetische hulpmiddelen die de ontwikkeling van S. venezuelae ATCC 10712 versnellen, evenals andere Streptomyces spp. modellen, zeer wenselijk voor natuurlijke producttechnologie en ontdekking. Hiertoe wordt in dit protocol een speciaal S. venezuelae ATCC 10712 celvrij systeem geleverd om hoogrenderende heterologe expressie van hoge G+C (%) genen mogelijk te maken. Dit protocol is geschikt voor kleinschalige (10-100 μL) batchreacties in 96-well of 384-well plaatformaat, terwijl reacties potentieel schaalbaar zijn. Het celvrije systeem is robuust en kan hoge opbrengsten bereiken (~ 5-10 μ M) voor een reeks recombinante eiwitten in een minimale opstelling. Dit werk omvat ook een brede plasmide-toolset voor real-time meting van mRNA- en eiwitsynthese, evenals in-gel fluorescentiekleuring van gelabelde eiwitten. Dit protocol kan ook worden geïntegreerd met high-throughput genexpressiekarakteriseringsworkflows of de studie van enzymroutes van hoge G + C (%) genen die aanwezig zijn in actinomycetengenomen.
Cell-free transcription-translation (TX-TL) systemen bieden een ideaal prototyping platform voor synthetische biologie om snelle design-build-test-learn cycli te implementeren, het conceptuele engineering framework voor synthetische biologie1. Daarnaast is er een groeiende belangstelling voor TX-TL-systemen voor hoogwaardige recombinante eiwitproductie in een open-reactieomgeving2, bijvoorbeeld om niet-standaard aminozuren op te nemen in antilichaam-geneesmiddelconjugaten3. In het bijzonder vereist TX-TL een celextract, plasmide of lineair DNA en een energieoplossing om eiwitsynthese in batch- of semicontinureacties te katalyseren. Hoewel Escherichia coli TX-TL het dominante celvrije systeem is, hebben een aantal opkomende tx-tl-systemen zonder model de aandacht getrokken voor verschillende toepassingen4,5,6,7,8. De belangrijkste voordelen van TX-TL zijn flexibele schaalbaarheid (nanoliter tot liter schaal)9,10, sterke reproduceerbaarheid en geautomatiseerde workflows8,11,12. Met name de automatisering van TX-TL maakt de versnelde karakterisering van genetische delen en regulerende elementen mogelijk8,12,13.
In termen van reactie-instelling vereist TX-TL zowel primaire als secundaire energiebronnen, evenals aminozuren, cofactoren, additieven en een sjabloon-DNA-sequentie. Nucleotidetrifosfaten (NTP’s) leveren de primaire energiebron om initieel mRNA (ATP, GTP, CTP en UTP) en eiwitsynthese (alleen ATP en GTP) aan te sturen. Om de TX-TL-opbrengsten te verhogen, worden NTP’s geregenereerd door het katabolisme van een secundaire energiebron, zoals maltose14, maltodextrine15, glucose14, 3-fosfoglyceraat (3-PGA)16, fosfoenolpyruvaat17 en L-glutamaat18. Deze inherente metabole activiteit is verrassend veelzijdig, maar toch slecht bestudeerd, vooral in opkomende TX-TL-systemen. Elke energiebron heeft verschillende eigenschappen en voordelen in termen van ATP-opbrengst, chemische stabiliteit en kosten, wat een belangrijke overweging is voor opgeschaalde TX-TL-reacties. Tot nu toe hebben de huidige protocollen voor E. coli TX-TL bereikt tot 4,0 mg / ml (~ 157 μM) voor het model groen fluorescerend eiwit (GFP), met behulp van een mengsel van 3-PGA (30 mM), maltodextrine (60 mM) en D-ribose (30 mM) als secundaire energiebron19.
Onlangs is er een toenemende interesse in het bestuderen van secundaire metaboliet biosynthetische routes in TX-TL-systemen20,21,22. In het bijzonder zijn Actinobacteriën een belangrijke bron van secundaire metabolieten, waaronder antibiotica en landbouwchemicaliën23,24. Hun genomen zijn verrijkt met zogenaamde biosynthetische genclusters (BGC’s), die coderen voor enzymatische routes voor secundaire metabolietbiosynthese. Voor de studie van actinobacteriën genetische delen en biosynthetische routes, zijn onlangs een reeks op Streptomyces gebaseerde TX-TL-systemen ontwikkeld5,6,25,26. Deze gespecialiseerde Streptomyces TX-TL-systemen zijn potentieel gunstig om de volgende redenen: [1] het leveren van een inheemse eiwitvouwingsomgeving voor enzymen uit Streptomyces spp.26; [2] toegang tot een optimale tRNA-pool voor hoge G+C (%) genexpressie; [3] actief primair metabolisme, dat mogelijk kan worden gekaapt voor de levering van biosynthetische precursoren; en [4] levering van enzymen, precursoren of cofactoren uit secundair metabolisme die aanwezig zijn in het inheemse celextract. Daarom is er onlangs een high-yield S.venezuelae TX-TL toolkit opgezet om deze unieke mogelijkheden te benutten5.
Streptomyces venezuelae is een opkomende gastheer voor synthetische biologie met een rijke geschiedenis in industriële biotechnologie5,27,28,29 en als modelsysteem voor het bestuderen van celdeling en genetische regulatie in Actinobacteria30,31,32. De belangrijkste typestam, S. venezuelae ATCC 10712, heeft een relatief groot genoom van 8,22 Mb met 72,5% G+C-gehalte (%) (Toetredingsnummer: CP029197), dat codeert voor 7377 coderende sequenties, 21 rRNA’s, 67 tRNA’s en 30 biosynthetische genclusters27. In de synthetische biologie is S. venezuelae ATCC 10712 een aantrekkelijk chassis voor de heterologe expressie van biosynthetische routes. In tegenstelling tot de meeste andere Streptomyces-vlekken biedt het verschillende belangrijke voordelen, waaronder een snelle verdubbelingstijd (~ 40 min), een uitgebreid scala aan genetische en experimentele hulpmiddelen5,28, gebrek aan myceliale klontering en sporulatie in vloeibare media28,33. Verschillende studies hebben ook het gebruik van S. venezuelae aangetoond voor heterologe productie van een breed scala aan secundaire metabolieten, waaronder polyketiden, ribosomale en niet-ribosomale peptiden34,35,36,37,38. Deze gecombineerde eigenschappen maken deze stam een aantrekkelijke microbiële gastheer voor synthetische biologie en metabole engineering toepassingen. Hoewel S. venezuelae niet het dominante Streptomyces-model is voor heterologe genexpressie, is het met verdere ontwikkelingen klaar voor breder gebruik binnen de ontdekking van natuurlijke producten.
Dit manuscript presenteert een gedetailleerd protocol (figuur 1) voor een hoog rendement S. venezuelae TX-TL-systeem, dat is bijgewerkt van het oorspronkelijke eerder gepubliceerde protocol26. In dit werk zijn de energieoplossing en reactieomstandigheden geoptimaliseerd om de eiwitopbrengst tot 260 μg / ml voor het mScarlet-I reporter-eiwit te verhogen in een batchreactie van 4 uur, 10 μL, met behulp van een standaard plasmide, pTU1-A-SP44-mScarlet-I. Dit plasmide is speciaal ontworpen om verschillende methoden voor het detecteren van eiwitexpressie mogelijk te maken. Het protocol is ook gestroomlijnd, terwijl het energiesysteem is geoptimaliseerd om de complexiteit en kosten van het opzetten van celvrije reacties te verminderen zonder de opbrengst in gevaar te brengen. Samen met het geoptimaliseerde TX-TL-systeem is een bibliotheek van genetische delen ontwikkeld voor het verfijnen van genexpressie en als fluorescerende hulpmiddelen voor het monitoren van TX-TL in realtime, waardoor een veelzijdig platform wordt gecreëerd voor het prototypen van genexpressie en biosynthetische routes van natuurlijke producten van Streptomyces spp. en gerelateerde Actinobacteriën.
In dit werk kan het aanbevolen standaard plasmide (pTU1-A-SP44-mScarlet-I) worden gebruikt om de S. venezuelae TX-TL-workflow in een nieuw laboratorium vast te stellen en is beschikbaar op AddGene (zie Aanvullende tabel S1). pTU1-A-SP44-mScarlet-I biedt de gebruiker de flexibiliteit om andere openleesframes (ORF’s) te bestuderen. De mScarlet-I ORF is codon-geoptimaliseerd voor S. venezuelae genexpressie. De SP44-promotor is een sterke constitutieve promotor die zeer actief is in zowel E. coli als Streptomyces spp.39. Het plasmide heeft twee unieke restrictie-enzymplaatsen (NdeI, BamHI) om het subklonen van nieuwe ORF’s in-frame mogelijk te maken met een gezamenlijk C-terminal FLAG-tag en fluoresceïne arsenisch haarspeldbocht (FlAsH) bindmiddeltagsysteem. Als alternatief kunnen beide tags worden verwijderd met de toevoeging van een stopcodon na het subklonen van een nieuw gen. Met deze basevector is de hoogrenderende expressie van een reeks eiwitten aangetoond, namelijk eiwitten uit de biosyntheseroute van oxytetracycline en een niet-gekarakteriseerd niet-ribosomaal peptidesynthetase (NRPS) van Streptomyces rimosus (figuur 2). In termen van mRNA-detectie bevat het pTU1-A-SP44-mScarlet-I standaard plasmide een dBroccoli aptamer (in het 3′-onvertaalde gebied) voor detectie met de 3,5-difluoro-4-hydroxybenzylideen imidazolinone (DFHBI) probe. Voor meer flexibiliteit is er ook een toolset van EcoFlex40-compatibele MoClo-onderdelen beschikbaar gesteld op AddGene, waaronder een EcoFlex-compatibele Streptomyces shuttle vector (pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP) en een reeks pTU1-A-SP44 variant plasmiden die superfolder groen fluorescentie-eiwit (sfGFP), mScarlet-I, mVenus-I en β-glucuronidase (GUS) tot expressie brengen. In het bijzonder is het pSF1C-A plasmide afgeleid van pAV-gapdh28 en wordt het genezen van BsaI/BsmBI-locaties voor MoClo-assemblage. pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP is gelijk aan pTU1-A-RFP/pTU2-A-RFP van EcoFlex40, maar bevat extra functionaliteit voor conjugatie en chromosomale integratie in Streptomyces spp. met behulp van het phiC31 integrase systeem28.
De eerste fase van het protocol omvat de groei van de S. venezuelae ATCC 10712 of een nauw verwante stam, celoogst in de mid-exponentiële fase, celwasstappen en equilibratie in S30A- en S30B-buffers. Deze fase duurt drie dagen en de tijd voor celgroei kan worden gebruikt om de resterende componenten voor te bereiden zoals hieronder beschreven. De geoogste cellen worden vervolgens gelyseerd door ultrasoonapparaat, verduidelijkt en ondergaan een afvloeiingsreactie. In deze laatste fase van de voorbereiding kunnen de celextracten worden voorbereid voor langdurige opslag bij -80 ° C om het verlies van activiteit te minimaliseren. Voor de assemblage van TX-TL-reacties met behulp van dit protocol wordt een Streptomyces Master Mix (SMM) gepresenteerd, met de optie van een Minimal Energy Solution-formaat (MES) dat vergelijkbare opbrengsten geeft. Verder wordt aanbevolen om een verse kweek van S. venezuelae ATCC 10712 van een -80 °C glycerolbouillon op een GYM-agarplaat te strooien en gedurende ten minste 48-72 uur bij 28 °C te incuberen totdat enkele kolonies zichtbaar zijn. Alleen verse culturen mogen worden gebruikt voor de volgende stappen.
In dit manuscript is een hoog rendement S. venezuelae TX-TL-protocol beschreven met gedetailleerde stappen die eenvoudig uit te voeren zijn voor zowel ervaren als nieuwe gebruikers van TX-TL-systemen. Verschillende functies van bestaande Streptomyces45– en E. coli TX-TL41-protocollen zijn verwijderd om een minimaal, maar toch hoog rendementsprotocol voor S. venezuelae TX-TL5,26 vast te stellen.<sup class…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen graag de volgende onderzoeksondersteuning erkennen: EPSRC [EP/K038648/1] voor SJM als een PDRA met PSF; Wellcome Trust sponsorde ISSF-fellowship voor SJM met PSF aan het Imperial College London; Royal Society onderzoeksbeurs [RGS\R1\191186]; Wellcome Trust SEED award [217528/Z/19/Z] voor SJM aan de Universiteit van Kent; en Global Challenges Research Fund (GCRF) Ph.D. beurs voor KC aan de Universiteit van Kent.
2.5 L UltraYield Flask | Thomson | 931136-B | |
3-PGA (>93%) | Sigma | P8877 | |
384 Well Black/Clear Bottom Plate | ThermoFisher | 10692202 | |
Ammonium chloride (98%) | Fluorochem | 44722 | |
ATP, CTP, UTP, GTP (100 mM solution, >99%) | ThermoFisher | R0481 | |
Carbenicillin (contact supplier for purity) | Melford | C46000-25.0 | |
D-(+)-glucose (contact supplier for purity) | Melford | G32040 | |
DFHBI (≥98% – HPLC) | Sigma | SML1627 | |
DTT (contact supplier for purity) | Melford | MB1015 | |
FlAsH-EDT2 (contact supplier for purity) | Santa Cruz Biotech | sc-363644 | |
Glucose-6-phosphate (>98%) | Sigma | G7879 | |
HEPES Free Acid (contact supplier for purity) | Melford | B2001 | |
L-glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate (>98%) | Sigma | 49605 | |
Magnesium chloride (98%) | Fluorochem | 494356 | |
Malt extract | Sigma | 70167-500G | |
PEG-6000 | Sigma | 807491 | |
Pierce 96-well Microdialysis Plate, 10K MWCO | ThermoFisher | 88260 | |
Poly(vinyl sulfate) potassium salt | Sigma | 271969 | |
Potassium glutamate (>99%) | Sigma | G1149 | |
RTS amino acid sampler | 5 Prime | 2401530 | |
Sodium chloride (99%) | Fluorochem | 94554 | |
Supelclean LC-18 SPE C-18 SPE column (1 g) | Sigma | 505471 | |
Yeast Extract | Melford | Y1333 | |
Equipment | |||
Platereader | BMG | Omega |