Ein ertragreiches Streptomyces-Transkriptions-Translation-Toolkit für synthetische Biologie und Naturstoffanwendungen
Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine verbesserte Methode zur Synthese hoher Ausbeuten rekombinanter Proteine aus einem zellfreien Transkriptionstranslationssystem (TX-TL) von Streptomyces venezuelae .
Abstract
Streptomyces spp. sind eine Hauptquelle für klinische Antibiotika und Industriechemikalien. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 ist eine schnell wachsende Sorte und ein natürlicher Produzent von Chloramphenicol, Jadomycin und Pikromycin, was es zu einem attraktiven Kandidaten als Chassis der synthetischen Biologie der nächsten Generation macht. Daher sind genetische Werkzeuge, die die Entwicklung von S. venezuelae ATCC 10712 sowie anderen Streptomyces spp.-Modellen beschleunigen, für die Naturproduktentwicklung und -entdeckung sehr wünschenswert. Zu diesem Zweck wird in diesem Protokoll ein dediziertes S. venezuelae ATCC 10712 zellfreies System bereitgestellt, um eine hochertragreiche heterologe Expression von Genen mit hohem G+C (%) zu ermöglichen. Dieses Protokoll eignet sich für kleinskalige (10-100 μL) Chargenreaktionen im 96-Well- oder 384-Well-Plattenformat, während die Reaktionen potenziell skalierbar sind. Das zellfreie System ist robust und kann hohe Ausbeuten (~ 5-10 μ M) für eine Reihe von rekombinanten Proteinen in einem minimalen Setup erzielen. Diese Arbeit beinhaltet auch ein breites Plasmid-Toolset für die Echtzeitmessung von mRNA und Proteinsynthese sowie die In-Gel-Fluoreszenzfärbung von markierten Proteinen. Dieses Protokoll kann auch in Hochdurchsatz-Genexpressionscharakterisierungs-Workflows oder die Untersuchung von Enzymwegen aus Genen mit hohem G + C (%) in Actinomycetes-Genomen integriert werden.
Introduction
Zellfreie Transkriptions-Translation-Systeme (TX-TL) bieten eine ideale Prototyping-Plattform für die synthetische Biologie, um schnelle Design-Build-Test-Learn-Zyklen zu implementieren, den konzeptionellen technischen Rahmen für die synthetische Biologie1. Darüber hinaus besteht ein wachsendes Interesse an TX-TL-Systemen für die hochwertige rekombinante Proteinproduktion in einer offenen Reaktionsumgebung2, um beispielsweise nicht-standardisierte Aminosäuren in Antikörper-Wirkstoff-Konjugate aufzunehmen3. Insbesondere benötigt TX-TL einen Zellextrakt, ein Plasmid oder lineare DNA und eine Energielösung, um die Proteinsynthese in Batch- oder semikontinuierlichen Reaktionen zu katalysieren. Während Escherichia coli TX-TL das dominierende zellfreie System ist, haben eine Reihe von aufkommenden Nicht-Modell-TX-TL-Systemen Aufmerksamkeit für verschiedene Anwendungen erregt4,5,6,7,8. Zu den Hauptvorteilen von TX-TL gehören die flexible Skalierbarkeit (Nanoliter-Liter-Skala)9,10, eine starke Reproduzierbarkeit und automatisierte Workflows8,11,12. Insbesondere die Automatisierung von TX-TL ermöglicht die beschleunigte Charakterisierung genetischer Teile und regulatorischer Elemente8,12,13.
In Bezug auf den Reaktionsaufbau benötigt TX-TL sowohl primäre als auch sekundäre Energiequellen sowie Aminosäuren, Cofaktoren, Additive und eine Template-DNA-Sequenz. Nukleotidtriphosphate (NTPs) stellen die primäre Energiequelle dar, um die anfängliche mRNA (ATP, GTP, CTP und UTP) und die Proteinsynthese (nur ATP und GTP) voranzutreiben. Um die TX-TL-Ausbeute zu erhöhen, werden NTPs durch den Katabolismus einer sekundären Energiequelle wie Maltose14, Maltodextrin15, Glucose14, 3-Phosphoglycerat (3-PGA)16, Phosphoenolpyruvat17 und L-Glutamat18 regeneriert. Diese inhärente Stoffwechselaktivität ist überraschend vielseitig, aber schlecht untersucht, insbesondere in aufkommenden TX-TL-Systemen. Jede Energiequelle hat unterschiedliche Eigenschaften und Vorteile in Bezug auf ATP-Ausbeute, chemische Stabilität und Kosten, was eine wichtige Überlegung für skalierte TX-TL-Reaktionen ist. Bisher haben die aktuellen Protokolle für E. coli TX-TL bis zu 4,0 mg/ml (~157 μM) für das grün fluoreszierende Modellprotein (GFP) erreicht, wobei eine Mischung aus 3-PGA (30 mM), Maltodextrin (60 mM) und D-Ribose (30 mM) als sekundäre Energiequelle verwendet wird19.
In jüngster Zeit ist das Interesse an der Untersuchung sekundärer Metaboliten-Biosynthesewege in TX-TL-Systemen gestiegen20,21,22. Insbesondere sind Actinobakterien eine Hauptquelle für Sekundärmetaboliten, einschließlich Antibiotika und Agrarchemikalien23,24. Ihre Genome sind mit sogenannten biosynthetischen Genclustern (BGCs) angereichert, die enzymatische Wege für die Sekundärmetabolit-Biosynthese kodieren. Für die Untersuchung der genetischen Teile von Actinobakterien und der Biosynthesewege wurde kürzlich eine Reihe von Streptomyces-basierten TX-TL-Systemen entwickelt5,6,25,26. Diese spezialisierten Streptomyces TX-TL-Systeme sind aus folgenden Gründen potenziell vorteilhaft: [1] Bereitstellung einer nativen Proteinfaltumgebung für Enzyme aus Streptomyces spp.26; [2] Zugang zu einem optimalen tRNA-Pool für eine hohe G+C (%) Genexpression; [3] aktiver Primärstoffwechsel, der möglicherweise für die Versorgung mit biosynthetischen Vorläufern missbraucht werden kann; und [4] Bereitstellung von Enzymen, Vorläufern oder Cofaktoren aus dem Sekundärstoffwechsel, die im nativen Zellextrakt vorhanden sind. Daher wurde kürzlich ein ertragreiches S.venezuelae TX-TL-Toolkit eingerichtet, um diese einzigartigen Fähigkeiten zu nutzen5.
Streptomyces venezuelae ist ein aufstrebender Wirt für synthetische Biologie mit einer reichen Geschichte in der industriellen Biotechnologie5,27,28,29 und als Modellsystem zur Untersuchung der Zellteilung und genetischen Regulation in Actinobakterien30,31,32. Der Haupttypstamm, S. venezuelae ATCC 10712, hat ein relativ großes Genom von 8,22 Mb mit 72,5% G+C-Gehalt (%) (Beitrittsnummer: CP029197), das für 7377 kodierende Sequenzen, 21 rRNAs, 67 tRNAs und 30 biosynthetische Gencluster kodiert27. In der synthetischen Biologie ist S. venezuelae ATCC 10712 ein attraktives Chassis für die heterologe Expression von Biosynthesewegen. Im Gegensatz zu den meisten anderen Streptomyces-Flecken bietet es mehrere wichtige Vorteile, darunter eine schnelle Verdopplungszeit (~ 40 min), eine umfangreiche Palette genetischer und experimenteller Werkzeuge5,28, eine fehlende Myzelverklumpung und Sporulation in flüssigen Medien28,33. Mehrere Studien haben auch die Verwendung von S. venezuelae für die heterologe Produktion einer Vielzahl von Sekundärmetaboliten gezeigt, darunter Polyketide, ribosomale und nichtribosomale Peptide34,35,36,37,38. Diese kombinierten Eigenschaften machen diesen Stamm zu einem attraktiven mikrobiellen Wirt für Anwendungen der synthetischen Biologie und des Metabolic Engineering. Während S. venezuelae nicht das dominierende Streptomyces-Modell für die heterologe Genexpression ist, ist es mit weiteren Entwicklungen für eine breitere Verwendung in der Naturproduktentdeckung vorbereitet.
Dieses Manuskript präsentiert ein detailliertes Protokoll (Abbildung 1) für ein S. venezuelae TX-TL-System mit hoher Ausbeute, das gegenüber dem ursprünglichen zuvor veröffentlichten Protokoll aktualisiert wurde26. In dieser Arbeit wurden die Energielösung und die Reaktionsbedingungen optimiert, um die Proteinausbeute für das mScarlet-I-Reporterprotein in einer 4 h, 10 μL Batch-Reaktion unter Verwendung eines Standardplasmids pTU1-A-SP44-mScarlet-I um bis zu 260 μg/ml zu erhöhen. Dieses Plasmid wurde speziell entwickelt, um verschiedene Methoden zum Nachweis der Proteinexpression zu ermöglichen. Das Protokoll ist ebenfalls optimiert, während das Energiesystem optimiert wurde, um die Komplexität und die Kosten für die Einrichtung zellfreier Reaktionen zu reduzieren, ohne die Ausbeute zu beeinträchtigen. Zusammen mit dem optimierten TX-TL-System wurde eine Bibliothek genetischer Teile zur Feinabstimmung der Genexpression und als fluoreszierende Werkzeuge zur Überwachung von TX-TL in Echtzeit entwickelt, wodurch eine vielseitige Plattform für das Prototyping von Genexpressions- und Naturstoff-Biosynthesewegen aus Streptomyces spp. und verwandten Actinobakterien geschaffen wurde.
In dieser Arbeit kann das empfohlene Standardplasmid (pTU1-A-SP44-mScarlet-I) verwendet werden, um den S. venezuelae TX-TL-Workflow in einem neuen Labor zu etablieren und ist auf AddGene verfügbar (siehe Ergänzende Tabelle S1). pTU1-A-SP44-mScarlet-I bietet dem Benutzer die Flexibilität, andere Open-Reading-Frames (ORFs) zu untersuchen. Der mScarlet-I ORF ist codon-optimiert für die S. venezuelae Genexpression. Der SP44-Promotor ist ein starker konstitutiver Promotor, der sowohl in E. coli als auch in Streptomyces spp.39 hochaktiv ist. Das Plasmid verfügt über zwei einzigartige Restriktionsenzymstellen (NdeI, BamHI), um das Subklonen neuer ORFs im Rahmen mit einem gemeinsamen C-terminalen FLAG-Tag und einem Fluorescein arsenischen Haarnadelsystem (FlAsH) zu ermöglichen. Alternativ können beide Tags mit der Aufnahme eines Stop-Codons nach dem Sub-Klonen eines neuen Gens entfernt werden. Mit diesem Basenvektor wurde die ertragreiche Expression einer Reihe von Proteinen nachgewiesen, nämlich Proteine aus dem Oxytetracyclin-Biosyntheseweg und eine uncharakterisierte nichtribosomale Peptidsynthetase (NRPS) aus Streptomyces rimosus (Abbildung 2). In Bezug auf den mRNA-Nachweis enthält das Standardplasmid pTU1-A-SP44-mScarlet-I ein dBroccoli-Aptamer (in der 3′-untranslatierten Region) zum Nachweis mit der 3,5-Difluor-4-hydroxybenzyliden-Imidazolinon (DFHBI) -Sonde. Für mehr Flexibilität wurde auch ein Toolset von EcoFlex40-kompatiblen MoClo-Teilen auf AddGene zur Verfügung gestellt, darunter ein EcoFlex-kompatibler Streptomyces-Shuttle-Vektor (pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP) und eine Reihe von pTU1-A-SP44-Variantenplasmiden, die Superfolder Green Fluorescence Protein (sfGFP), mScarlet-I, mVenus-I und β-Glucuronidase (GUS) exprimieren. Insbesondere wird das pSF1C-A-Plasmid von pAV-gapdh28 abgeleitet und von BsaI/BsmBI-Stellen für die MoClo-Assemblierung ausgehärtet. pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP entspricht pTU1-A-RFP/pTU2-A-RFP von EcoFlex40, enthält jedoch zusätzliche Funktionen für die Konjugation und chromosomale Integration in Streptomyces spp. mit dem phiC31-Integrasesystem28.
Die erste Stufe des Protokolls umfasst das Wachstum des S. venezuelae ATCC 10712 oder eines eng verwandten Stammes, die Zellernte in der mittleren exponentiellen Phase, Zellwaschschritte und die Äquilibrierung in S30A- und S30B-Puffern. Diese Phase dauert drei Tage, und die Zeit für das Zellwachstum kann verwendet werden, um die verbleibenden Komponenten wie unten beschrieben vorzubereiten. Die geernteten Zellen werden dann durch Beschallung lysiert, geklärt und durchlaufen eine Abflussreaktion. In dieser letzten Phase der Vorbereitung können die Zellextrakte für die Langzeitlagerung bei -80 °C vorbereitet werden, um den Aktivitätsverlust zu minimieren. Für die Montage von TX-TL-Reaktionen mit diesem Protokoll wird ein Streptomyces Master Mix (SMM) vorgestellt, mit der Option eines Minimal Energy Solution-Formats (MES), das vergleichbare Ausbeuten liefert. Ferner wird empfohlen, eine frische Kultur von S. venezuelae ATCC 10712 aus einem -80 °C Glycerinvorrat auf eine GYM-Agarplatte zu streifen und bei 28 °C für mindestens 48-72 h zu inkubieren, bis einzelne Kolonien sichtbar sind. Für die folgenden Schritte sollten nur frische Kulturen verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Manuskript wurde ein ertragreiches S. venezuelae TX-TL-Protokoll mit detaillierten Schritten beschrieben, die sowohl für erfahrene als auch für neue Benutzer von TX-TL-Systemen einfach durchzuführen sind. Mehrere Funktionen aus den bestehenden Streptomyces45– und E. coli TX-TL41-Protokollen wurden entfernt, um ein minimales, aber ertragreiches Protokoll für S. venezuelae TX-TL5,26 zu etablieren.<…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken für folgende Forschungsunterstützung: EPSRC [EP/K038648/1] für SJM als PDRA mit PSF; Wellcome Trust sponserte ISSF-Stipendium für SJM mit PSF am Imperial College London; Forschungsstipendium der Royal Society [RGS\R1\191186]; Wellcome Trust SEED Award [217528/Z/19/Z] für SJM an der University of Kent; und Global Challenges Research Fund (GCRF) Ph.D. Stipendium für KC an der University of Kent.
Materials
| 2.5 L UltraYield Flask | Thomson | 931136-B | |
| 3-PGA (>93%) | Sigma | P8877 | |
| 384 Well Black/Clear Bottom Plate | ThermoFisher | 10692202 | |
| Ammonium chloride (98%) | Fluorochem | 44722 | |
| ATP, CTP, UTP, GTP (100 mM solution, >99%) | ThermoFisher | R0481 | |
| Carbenicillin (contact supplier for purity) | Melford | C46000-25.0 | |
| D-(+)-glucose (contact supplier for purity) | Melford | G32040 | |
| DFHBI (≥98% – HPLC) | Sigma | SML1627 | |
| DTT (contact supplier for purity) | Melford | MB1015 | |
| FlAsH-EDT2 (contact supplier for purity) | Santa Cruz Biotech | sc-363644 | |
| Glucose-6-phosphate (>98%) | Sigma | G7879 | |
| HEPES Free Acid (contact supplier for purity) | Melford | B2001 | |
| L-glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate (>98%) | Sigma | 49605 | |
| Magnesium chloride (98%) | Fluorochem | 494356 | |
| Malt extract | Sigma | 70167-500G | |
| PEG-6000 | Sigma | 807491 | |
| Pierce 96-well Microdialysis Plate, 10K MWCO | ThermoFisher | 88260 | |
| Poly(vinyl sulfate) potassium salt | Sigma | 271969 | |
| Potassium glutamate (>99%) | Sigma | G1149 | |
| RTS amino acid sampler | 5 Prime | 2401530 | |
| Sodium chloride (99%) | Fluorochem | 94554 | |
| Supelclean LC-18 SPE C-18 SPE column (1 g) | Sigma | 505471 | |
| Yeast Extract | Melford | Y1333 | |
| Equipment | |||
| Platereader | BMG | Omega |
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