ערכת כלים לתרגום תמלול סטרפטומיצ'ס בתפוקה גבוהה לביולוגיה סינתטית ויישומי מוצרים טבעיים
Summary
פרוטוקול זה מפרט שיטה משופרת לסינתזה של תשואות גבוהות של חלבונים רקומביננטיים ממערכת תרגום שעתוק ללא תאים (TX-TL) של סטרפטומיצ’ס ונצואלה .
Abstract
סטרפטומיצ’ים spp. הם מקור עיקרי של אנטיביוטיקה קלינית וכימיקלים תעשייתיים. סטרפטומיצ’ס ונצואלה ATCC 10712 הוא זן הגדל במהירות ויצרן טבעי של כלורמפניקול, ג’דומיניצין ופיקרומיצין, מה שהופך אותו למועמד אטרקטיבי כשלדה ביולוגית סינתטית מהדור הבא. לכן, כלים גנטיים המאיצים את הפיתוח של S. ונצואלה ATCC 10712, כמו גם מודלים אחרים של סטרפטומיצ’ס spp. , רצויים מאוד להנדסת מוצר טבעי וגילוי. לשם כך, מערכת ייעודית S. venezuelae ATCC 10712 ללא תאים מסופקת בפרוטוקול זה כדי לאפשר ביטוי הטרולוגי בעל תפוקה גבוהה של גנים G+C גבוהים (%) פרוטוקול זה מתאים לתגובות אצווה בקנה מידה קטן (10-100 μL) בתבנית צלחת 96-well או 384-well, בעוד התגובות עשויות להיות מדרגיות. המערכת נטולת התאים חזקה ויכולה להשיג תשואות גבוהות (~5-10 μ M) עבור מגוון חלבונים רקומביננטיים במערך מינימלי. עבודה זו משלבת גם ערכת כלים פלסמידית רחבה למדידה בזמן אמת של mRNA וסינתזת חלבונים, כמו גם כתמי פלואורסצנטיות בג’ל של חלבונים מתויגים. פרוטוקול זה יכול להיות משולב גם עם זרימות עבודה אפיון ביטוי גנים תפוקה גבוהה או המחקר של מסלולי אנזים מ G + C גבוה (%) גנים נוכחים בגנום Actinomycetes.
Introduction
מערכות תרגום תמלול ללא תאים (TX-TL) מספקות פלטפורמת אב-טיפוס אידיאלית לביולוגיה סינתטית ליישום מחזורי תכנון-בנייה-למידה מהירים, מסגרת ההנדסה המושגית לביולוגיה סינתטית1. בנוסף, יש עניין גובר במערכות TX-TL לייצור חלבון רקומביננטי בעל ערך גבוה בסביבה של תגובה פתוחה2, למשל, לשלב חומצות אמינו לא סטנדרטיות בהצמדות נוגדנים-תרופתיות3. באופן ספציפי, TX-TL דורש תמצית תאים, פלסמיד או DNA ליניארי, ופתרון אנרגיה כדי לזרז את סינתזת החלבון בתגובות אצווה או חצי יבשתיות. בעוד Escherichia coli TX-TL היא המערכת הדומיננטית ללא תאים, מספר מערכות TX-TL שאינן מודל המתעוררות משכו תשומת לב עבור יישומים שונים4,5,6,7,8. היתרונות העיקריים של TX-TL כוללים מדרגיות גמישה (ננו-ליטר בקנה מידה ליטר)9,10, רבייה חזקה וזרימות עבודה אוטומטיות8,11,12. בפרט, אוטומציה של TX-TL מאפשרת אפיון מואץ של חלקים גנטיים ואלמנטים רגולטוריים8,12,13.
במונחים של הגדרת תגובה, TX-TL דורש מקורות אנרגיה ראשוניים ומשניים, כמו גם חומצות אמינו, קופקטורים, תוספים, ורצף DNA תבנית. נוקלאוטיד טריפוספטים (NTPs) מספקים את מקור האנרגיה העיקרי להנעת mRNA ראשוני (ATP, GTP, CTP ו- UTP) וסינתזת חלבונים (רק ATP ו- GTP). כדי להגדיל את תשואות TX-TL, NTPs מתחדשים באמצעות קטבוליזם של מקור אנרגיה משני, כגון מלטוז14, מלטודקסטרין15, גלוקוז14, 3-phosphoglycerate (3-PGA)16, phosphoenolpyruvate17, ו L-גלוטמט18. פעילות מטבולית טבועה זו היא מגוונת באופן מפתיע, אך נחקרה בצורה גרועה, במיוחד במערכות TX-TL המתעוררות. לכל מקור אנרגיה יש מאפיינים ויתרונות ברורים במונחים של תשואת ATP, יציבות כימית ועלות, המהווה שיקול חשוב לתגובות TX-TL מוגדלות. עד כה, הפרוטוקולים הנוכחיים עבור E. coli TX-TL הגיעו עד 4.0 מ”ג / מ”ל (~ 157 מיקרומטר) עבור חלבון פלואורסצנטי ירוק מודל (GFP), באמצעות תערובת של 3-PGA (30 מ”מM), מלטודקסטרין (60 מ”מ) ו D-ריבוז (30 מ”מ) כמקור האנרגיה המשני19.
לאחרונה, יש כבר עניין גובר בחקר מסלולים biosynthetic מטבוליט משני במערכות TX-TL20,21,22. באופן ספציפי, Actinobacteria הם מקור עיקרי של מטבוליטים משניים, כולל אנטיביוטיקה וכימיקלים חקלאיים23,24. הגנום שלהם מועשר במה שמכונה אשכולות גנים ביוסינתטיים (BGCs), המקודדים מסלולים אנזימטיים לביוסינתזה מטבולית משנית. לחקר חלקים גנטיים Actinobacteria ומסלולים biosynthetic, מגוון של מערכות TX-TL מבוססי סטרפטומיצ’ס פותחו לאחרונה5,6,25,26. מערכות TX-TL מיוחדות אלה של סטרפטומיצ’ס עשויות להועיל מהסיבות הבאות: [1] אספקת סביבת קיפול חלבונים מקומית לאנזימים מסטרפטומיצ’ס spp.26; [2] גישה למאגר tRNA אופטימלי לביטוי גנים G+C (%) גבוה; [3] חילוף חומרים ראשוני פעיל, אשר עלול להיחטף לאספקת מבשרים biosynthetic; ו[4] אספקת אנזימים, מבשרי או קופקטורים מחילוף החומרים המשני הקיימים בתמצית התאים המקומיים. לפיכך, ערכת כלים TX-TL TX-TL של S.venezuelae בעלת תפוקה גבוהה הוקמה לאחרונה כדי לרתום את היכולות הייחודיות הללו5.
סטרפטומיצ’ס ונצואלה היא מארחת מתפתחת לביולוגיה סינתטית עם היסטוריה עשירה בביוטכנולוגיה תעשייתית5,27,28,29 וכמערכת מודל לחקר חלוקת תאים ורגולציה גנטית באקטינובקטריה30,31,32. זן הסוג העיקרי, S. venezuelae ATCC 10712, יש גנום גדול יחסית של 8.22 Mb עם 72.5% תוכן G +C (%) (מספר גישה: CP029197), המקודד 7377 רצפי קידוד, 21 rRNAs, 67 tRNAs, ו 30 אשכולות גנים biosynthetic27. בביולוגיה סינתטית, S. venezuelae ATCC 10712 הוא שלדה אטרקטיבית לביטוי ההטרולוגי של מסלולים biosynthetic. שלא כמו רוב כתמי סטרפטומיצ’ס האחרים, הוא מספק מספר יתרונות מרכזיים, כולל זמן הכפלה מהיר (~ 40 דקות), מגוון רחב של כלים גנטיים וניסיוניים5,28, חוסר גושי תפטיר, וספורציה במדיה נוזלית28,33. מספר מחקרים הדגימו גם את השימוש ב- S. ונצואלה לייצור הטרולוגי של מגוון רחב של מטבוליטים משניים, כולל פוליקטידים, פפטידים ריבוזומליים ולא ריבוסומיים34,35,35,36,37,38. תכונות משולבות אלה הופכות את הזן הזה למארח מיקרוביאלי אטרקטיבי לביולוגיה סינתטית ויישומי הנדסה מטבולית. בעוד S. ונצואלה אינה מודל סטרפטומיצ’ס הדומיננטי לביטוי גנים הטרולוגיים, עם התפתחויות נוספות, היא מוכנה לשימוש רחב יותר בתוך גילוי מוצרים טבעיים.
כתב יד זה מציג פרוטוקול מפורט (איור 1) עבור מערכת TX-TL של S. ונצואלה בעלת תפוקה גבוהה, שעודכנה מהפרוטוקול המקורי שפורסם בעבר26. בעבודה זו, פתרון האנרגיה ותנאי התגובה עברו אופטימיזציה כדי להגדיל את תפוקת החלבון עד 260 מיקרוגרם / מ”ל עבור חלבון כתב mScarlet-I בתגובת אצווה של 4 שעות, 10 μL, באמצעות פלסמיד סטנדרטי, pTU1-A-SP44-mScarlet-I. פלסמיד זה תוכנן במיוחד כדי לאפשר שיטות שונות של זיהוי ביטוי חלבון. הפרוטוקול גם יעיל, בעוד שמערכת האנרגיה עברה אופטימיזציה כדי להפחית את המורכבות והעלות של הגדרת תגובות ללא תאים מבלי להתפשר על התשואה. יחד עם מערכת TX-TL הממוטבת, פותחה ספרייה של חלקים גנטיים לביטוי גנים לכוונון עדין וכלים פלואורסצנטיים לניטור TX-TL בזמן אמת, ובכך נוצרה פלטפורמה רב-תכליתית לביטוי גנים אב-טיפוס ולמסלולים ביוסינתזיים של מוצרים טבעיים מסטרפטומיצ’ס spp. ו- Actinobacteria הקשורים.
בעבודה זו, הפלסמיד הסטנדרטי המומלץ (pTU1-A-SP44-mScarlet-I) יכול לשמש להקמת זרימת העבודה של S. venezuelae TX-TL במעבדה חדשה והוא זמין ב- AddGene (ראה טבלה משלימה S1). pTU1-A-SP44-mScarlet-I מספק למשתמש את הגמישות ללמוד מסגרות קריאה פתוחות אחרות (ORFs). mScarlet-I ORF ממוטב קודון לביטוי הגנים של S. venezuelae. מקדם SP44 הוא מקדם מכונן חזק כי הוא פעיל מאוד הן E. coli ו Streptomyces spp.39. הפלסמיד כולל שני אתרי אנזימי הגבלה ייחודיים (NdeI, BamHI) כדי לאפשר שיבוט משנה של ORFs חדשים במסגרת עם תג דגל מסוף C משותף ומערכת תג סיכות ראש ארסנית פלואורסצ’ין (FlAsH). לחלופין, ניתן להסיר את שני התגים עם הכללת קודון עצירה לאחר שיבוט משנה של גן חדש. עם וקטור הבסיס הזה, הוכח הביטוי בעל התפוקה הגבוהה של מגוון חלבונים, כלומר חלבונים ממסלול הביוסינתזה האוקסיטקסטילציקלין וסינתטאז פפטיד לא אופייני (NRPS) מסטרפטומיצ’ס רימוזוסוס (איור 2). במונחים של זיהוי mRNA, pTU1-A-SP44-mScarlet-I פלסמיד סטנדרטי מכיל aptamer dBroccoli (באזור 3′-untranslated) לגילוי עם 3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene imidazolinonee (DFHBI) בדיקה. לקבלת גמישות מוגברת, ערכת כלים של חלקי MoClo תואמי EcoFlex40 הפכה לזמינה גם ב- AddGene, כולל וקטור שאטל סטרפטומיצ’ס תואם EcoFlex (pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP) ומגוון פלסמידים וריאנט pTU1-A-SP44 המבטאים חלבון פלואורסצנטיות ירוק סופר-תיקייתי (sfGFP), mScarlet-I, mVenus-I ו- β-glucuronidase (GUS). בפרט, pSF1C-A plasmid נגזר pAV-gapdh28 והוא נרפא של אתרי BsaI / BsmBI להרכבה MoClo. pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP שווה ערך ל-pTU1-A-RFP/pTU2-A-RFP מ-EcoFlex40, אך מכיל פונקציונליות נוספת להטיה ואינטגרציה כרומוזומלית בסטרפטומיצ’ים spp. באמצעות מערכת integrase phiC3128.
השלב הראשון של הפרוטוקול כרוך בצמיחה של S. ונצואלה ATCC 10712 או זן קרוב, קציר תאים בשלב אמצע מעריכי, שלבי שטיפת תאים, ושיווי משקל במאגרי S30A ו- S30B. שלב זה דורש שלושה ימים, ואת הזמן לצמיחת התא יכול לשמש כדי להכין את הרכיבים הנותרים כמתואר להלן. התאים שנקטפו הם אז lysed על ידי sonication, הובהר, ולעבור תגובה בורחת. בשלב זה של הכנה, תמציות התא יכול להיות מוכן לאחסון לטווח ארוך ב -80 °C (80 °F) כדי למזער את אובדן הפעילות. עבור הרכבה של תגובות TX-TL באמצעות פרוטוקול זה, Streptomyces מאסטר Mix (SMM) מוצג, עם אפשרות של תבנית פתרון אנרגיה מינימלית (MES) המעניקה תשואות דומות. כמו כן, מומלץ פס תרבות טרייה של S. ונצואלה ATCC 10712 ממלאי גליצרול -80 °C (80 °F) על צלחת אגר חדר כושר ודגור ב 28 °C (68 °F) לפחות 48-72 שעות עד מושבות בודדות גלויים. יש להשתמש רק בתרבויות טריות עבור השלבים הבאים.
Protocol
Representative Results
Discussion
בכתב יד זה תואר פרוטוקול TX-TL של S. ונצואלה בעל תפוקה גבוהה עם צעדים מפורטים שהם פשוטים לניהול עבור משתמשים מנוסים וחדשים של מערכות TX-TL. מספר תכונות מפרוטוקולי Streptomyces45 ו- E. coli TX-TL41 הקיימים הוסרו כדי ליצור פרוטוקול מינימלי אך בעל תפוקה גבוהה עבור S. venezuelae TX-TL5,26.<su…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להכיר בתמיכה המחקרית הבאה: EPSRC [EP/K038648/1] עבור SJM כ- PDRA עם PSF; Wellcome Trust מימנה את מלגת ISSF עבור SJM עם PSF באימפריאל קולג’ בלונדון; מענק המחקר של החברה המלכותית [RGS\R1\191186]; פרס Wellcome Trust SEED [217528/Z/Z/19/Z] עבור SJM באוניברסיטת קנט; ומלגת דוקטורט ל-Ph.D. של קרן מחקר האתגרים הגלובליים (GCRF) עבור KC באוניברסיטת קנט.
Materials
| 2.5 L UltraYield Flask | Thomson | 931136-B | |
| 3-PGA (>93%) | Sigma | P8877 | |
| 384 Well Black/Clear Bottom Plate | ThermoFisher | 10692202 | |
| Ammonium chloride (98%) | Fluorochem | 44722 | |
| ATP, CTP, UTP, GTP (100 mM solution, >99%) | ThermoFisher | R0481 | |
| Carbenicillin (contact supplier for purity) | Melford | C46000-25.0 | |
| D-(+)-glucose (contact supplier for purity) | Melford | G32040 | |
| DFHBI (≥98% – HPLC) | Sigma | SML1627 | |
| DTT (contact supplier for purity) | Melford | MB1015 | |
| FlAsH-EDT2 (contact supplier for purity) | Santa Cruz Biotech | sc-363644 | |
| Glucose-6-phosphate (>98%) | Sigma | G7879 | |
| HEPES Free Acid (contact supplier for purity) | Melford | B2001 | |
| L-glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate (>98%) | Sigma | 49605 | |
| Magnesium chloride (98%) | Fluorochem | 494356 | |
| Malt extract | Sigma | 70167-500G | |
| PEG-6000 | Sigma | 807491 | |
| Pierce 96-well Microdialysis Plate, 10K MWCO | ThermoFisher | 88260 | |
| Poly(vinyl sulfate) potassium salt | Sigma | 271969 | |
| Potassium glutamate (>99%) | Sigma | G1149 | |
| RTS amino acid sampler | 5 Prime | 2401530 | |
| Sodium chloride (99%) | Fluorochem | 94554 | |
| Supelclean LC-18 SPE C-18 SPE column (1 g) | Sigma | 505471 | |
| Yeast Extract | Melford | Y1333 | |
| Equipment | |||
| Platereader | BMG | Omega |
Riferimenti
- Carbonell, P., et al. An automated Design-Build-Test-Learn pipeline for enhanced microbial production of fine chemicals. Communications Biology. 1, 66 (2018).
- Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user’s guide to cell-free protein synthesis. Methods Protocols. 2 (1), 24 (2019).
- Zimmerman, E. S., et al. Production of site-specific antibody-drug conjugates using optimized non-natural amino acids in a cell-free expression system. Bioconjugate Chemistry. 25 (2), 351-361 (2014).
- Wiegand, D. J., Lee, H. H., Ostrov, N., Church, G. M. Cell-free protein expression using the rapidly growing bacterium Vibrio natriegens. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), e59495 (2019).
- Moore, S. J., et al. A Streptomyces venezuelae cell-free toolkit for synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 10 (2), 402-411 (2021).
- Xu, H., Liu, W. -. Q., Li, J. Translation related factors improve the productivity of a Streptomyces-based cell-free protein synthesis system. ACS Synthetic Biology. 9 (5), 1221-1224 (2020).
- Yim, S. S., et al. Multiplex transcriptional characterizations across diverse bacterial species using cell-free systems. Molecular Systems Biology. 15 (8), 8875 (2019).
- Moore, S. J., et al. Rapid acquisition and model-based analysis of cell-free transcription-translation reactions from nonmodel bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4340-4349 (2018).
- Zawada, J. F., et al. Microscale to manufacturing scale-up of cell-free cytokine production–a new approach for shortening protein production development timelines. Biotechnology and Bioengineering. 108 (7), 1570-1578 (2011).
- Geertz, M., Shore, D., Maerkl, S. J. Massively parallel measurements of molecular interaction kinetics on a microfluidic platform. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (41), 16540-16545 (2012).
- McManus, J. B., Emanuel, P. A., Murray, R. M., Lux, M. W. A method for cost-effective and rapid characterization of engineered T7-based transcription factors by cell-free protein synthesis reveals insights into the regulation of T7 RNA polymerase-driven expression. Archives of Biochemistry and Biophysics. 674, 108045 (2019).
- McManus, J. B., et al. A method for cost-effective and rapid characterization of genetic parts. bioRxiv. , (2021).
- Park, J., Yim, S. S., Wang, H. H. High-throughput transcriptional characterization of regulatory sequences from bacterial Biosynthetic Gene Clusters. ACS Synthetic Biology. , (2021).
- Caschera, F., Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie. 99, 162-168 (2014).
- Caschera, F., Noireaux, V. A cost-effective polyphosphate-based metabolism fuels an all E. coli cell-free expression system. Metabolic Engineering. 27, 29-37 (2015).
- Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4, 8 (2010).
- Karim, A. S., Heggestad, J. T., Crowe, S. A., Jewett, M. C. Controlling cell-free metabolism through physiochemical perturbations. Metabolic Engineering. 45, 86-94 (2018).
- Cai, Q., et al. A simplified and robust protocol for immunoglobulin expression in Escherichia coli cell-free protein synthesis systems. Biotechnology Progress. 31 (3), 823-831 (2015).
- Garenne, D., Thompson, S., Brisson, A., Khakimzhan, A., Noireaux, V. The all-E. coli TXTL toolbox 3.0: New capabilities of a cell-free synthetic biology platform. Synthetic Biology. , (2021).
- Goering, A. W., et al. In vitro reconstruction of nonribosomal peptide biosynthesis directly from DNA using cell-free protein synthesis. ACS Synthetic Biology. 6 (1), 39-44 (2017).
- Khatri, Y., et al. Multicomponent microscale biosynthesis of unnatural cyanobacterial indole alkaloids. ACS Synthetic Biology. 9 (6), 1349-1360 (2020).
- Zhuang, L., et al. Total in vitro biosynthesis of the nonribosomal macrolactone peptide valinomycin. Metabolic Engineering. 60, 37-44 (2020).
- Hoskisson, P. A., Seipke, R. F. Cryptic or silent? The known unknowns, unknown knowns, and unknown unknowns of secondary metabolism. mBio. 11 (5), 02642 (2020).
- Bentley, S. D., et al. Complete genome sequence of the model actinomycete Streptomyces coelicolor A3(2). Nature. 417 (6885), 141-147 (2002).
- Li, J., Wang, H., Kwon, Y. -. C., Jewett, M. C. Establishing a high yielding Streptomyces-based cell-free protein synthesis system. Biotechnology and Bioengineering. 114 (6), 1343-1353 (2017).
- Moore, S. J., Lai, H. -. E., Needham, H., Polizzi, K. M., Freemont, P. S. Streptomyces venezuelae TX-TL – a next generation cell-free synthetic biology tool. Biotechnology Journal. 12 (4), (2017).
- Kim, W., et al. Comparative genomics determines strain-dependent secondary metabolite production in Streptomyces venezuelae strains. Biomolecules. 10 (6), 864 (2020).
- Phelan, R. M., et al. Development of next generation synthetic biology tools for use in Streptomyces venezuelae. ACS Synthetic Biology. 6 (1), 159-166 (2017).
- Song, J. Y., et al. Complete genome sequence of Streptomyces venezuelae ATCC 15439, a promising cell factory for production of secondary metabolites. Journal of Biotechnology. 219, 57-58 (2016).
- Bush, M. J., Bibb, M. J., Chandra, G., Findlay, K. C., Buttner, M. J. Genes required for aerial growth, cell division, and chromosome segregation are targets of WhiA before sporulation in Streptomyces venezuelae. mBio. 4 (5), 00684 (2013).
- Schumacher, M. A., et al. The crystal structure of the RsbN-σBldN complex from Streptomyces venezuelae defines a new structural class of anti-σ factor. Nucleic Acids Research. 46 (14), 7405-7417 (2018).
- Ramos-León, F., et al. A conserved cell division protein directly regulates FtsZ dynamics in filamentous and unicellular actinobacteria. Elife. 10, 63387 (2021).
- Bush, M. J., Tschowri, N., Schlimpert, S., Flärdh, K., Buttner, M. J. c-di-GMP signalling and the regulation of developmental transitions in Streptomycetes. Nature Reviews. Microbiology. 13 (12), 749-760 (2015).
- Ehrlich, J., Gottlieb, D., Burkholder, P. R., Anderson, L. E., Pridham, T. G. Streptomyces venezuelae, n. sp., the source of chloromycetin. Journal of Bacteriology. 56 (4), 467-477 (1948).
- Inahashi, Y., et al. Watasemycin biosynthesis in Streptomyces venezuelae: thiazoline C-methylation by a type B radical-SAM methylase homologue. Chemical Science. 8 (4), 2823-2831 (2017).
- Jakeman, D. L., et al. Antimicrobial activities of jadomycin B and structurally related analogues. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (3), 1245-1247 (2009).
- Kodani, S., Sato, K., Hemmi, H., Ohnish-Kameyama, M. Isolation and structural determination of a new hydrophobic peptide venepeptide from Streptomyces venezuelae. Journal of Antibiotics. 67 (12), 839-842 (2014).
- Akey, D. L., et al. Structural basis for macrolactonization by the pikromycin thioesterase. Nature Chemical Biology. 2 (10), 537-542 (2006).
- Bai, C., et al. Exploiting a precise design of universal synthetic modular regulatory elements to unlock the microbial natural products in Streptomyces. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (39), 12181-12186 (2015).
- Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50762 (2013).
- Kim, D. M., Choi, C. Y. A semicontinuous prokaryotic coupled transcription/translation system using a dialysis membrane. Biotechnology Progress. 12 (5), 645-649 (1996).
- Liu, Y., Fritz, B. R., Anderson, M. J., Schoborg, J. A., Jewett, M. C. Characterizing and alleviating substrate limitations for improved in vitro ribosome construction. ACS Synthetic Biology. 4 (4), 454-462 (2015).
- Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nature Methods. 14, 53-56 (2017).
- Hopword, D. A., Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K. Practical Streptomyces genetics. John Innes Foundation. , (2000).
- Hunter, D. J. B., Bhumkar, A., Giles, N., Sierecki, E., Gambin, Y. Unexpected instabilities explain batch-to-batch variability in cell-free protein expression systems. Biotechnology and Bioengineering. 115 (8), 1904-1914 (2018).
- Dopp, J. L., Jo, Y. R., Reuel, N. F. Methods to reduce variability in E. coli-based cell-free protein expression experiments. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
- Hoff, G., Bertrand, C., Piotrowski, E., Thibessard, A., Leblond, P. Genome plasticity is governed by double strand break DNA repair in Streptomyces. Scientific Reports. 8, 5272 (2018).
- Bibb, M. J. Regulation of secondary metabolism in streptomycetes. Current Opinion in Microbiology. 8 (2), 208-215 (2005).
- Weber, T., et al. antiSMASH 3.0-a comprehensive resource for the genome mining of biosynthetic gene clusters. Nucleic Acids Research. 43 (1), 237-243 (2015).
- Navarro-Muñoz, J. C., et al. A computational framework to explore large-scale biosynthetic diversity. Nature Chemical Biology. 16, 60-68 (2020).
- Alanjary, M., et al. The Antibiotic Resistant Target Seeker (ARTS), an exploration engine for antibiotic cluster prioritization and novel drug target discovery. Nucleic Acids Research. 45 (1), 42-48 (2017).
- Medema, M. H., Fischbach, M. A. Computational approaches to natural product discovery. Nature Chemical Biology. 11 (9), 639-648 (2015).
- Whitford, C. M., Cruz-Morales, P., Keasling, J. D., Weber, T. The Design-Build-Test-Learn cycle for metabolic engineering of Streptomycetes. Essays in Biochemistry. , (2021).
