Method Article

Un toolkit di trascrizione-traduzione di streptomyces ad alto rendimento per la biologia sintetica e le applicazioni dei prodotti naturali

DOI:

10.3791/63012

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September 10th, 2021

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1Centre for Synthetic Biology and Innovation, South Kensington Campus, 2Department of Medicine, South Kensington Campus, 3Section of Structural and Synthetic Biology, Department of Infectious Disease, Imperial College London, 4Sir Alexander Fleming Building, South Kensington Campus, 5School of Biosciences, Division of Natural Sciences, University of Kent, 6UK Dementia Research Institute Care Research and Technology Centre, Imperial College London; Hammersmith Campus, 7UK Innovation and Knowledge Centre for Synthetic Biology (SynbiCITE) and the London Biofoundry, Imperial College Translation & Innovation Hub

In This Article

Summary

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Questo protocollo descrive in dettaglio un metodo avanzato per sintetizzare alte rese di proteine ricombinanti da un sistema di trascrizione senza cellule streptomyces venezuelae (TX-TL).

Abstract

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Streptomyces spp. sono una delle principali fonti di antibiotici clinici e prodotti chimici industriali. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 è una varietà in rapida crescita e un produttore naturale di cloramfenicolo, jadomicina e pikromicina, il che lo rende un candidato attraente come telaio di biologia sintetica di prossima generazione. Pertanto, gli strumenti genetici che accelerano lo sviluppo di S. venezuelae ATCC 10712, così come altri modelli di Streptomyces spp., sono altamente desiderabili per l'ingegneria e la scoperta di prodotti naturali. A tal fine, in questo protocollo viene fornito un sistema S . venezuelae ATCC 10712 privo di cellule dedicato per consentire l'espressione eterologa ad alto rendimento di geni ad alto G + C (%). Questo protocollo è adatto per reazioni batch su piccola scala (10-100 μL) in formato piastra a 96 pozzetti o 384 pozzetti, mentre le reazioni sono potenzialmente scalabili. Il sistema privo di cellule è robusto e può raggiungere rese elevate (~ 5-10 μ M) per una gamma di proteine ricombinanti in una configurazione minima. Questo lavoro incorpora anche un ampio set di strumenti plasmidici per la misurazione in tempo reale dell'mRNA e della sintesi proteica, nonché la colorazione a fluorescenza in gel delle proteine marcate. Questo protocollo può anche essere integrato con flussi di lavoro di caratterizzazione dell'espressione genica ad alto rendimento o con lo studio di percorsi enzimatici da geni ad alto G + C (%) presenti nei genomi di Actinomiceti.

Introduction

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I sistemi di trascrizione-traduzione senza cellule (TX-TL) forniscono una piattaforma di prototipazione ideale per la biologia sintetica per implementare cicli rapidi di progettazione-costruzione-test-apprendimento, il framework di ingegneria concettuale per la biologia sintetica1. Inoltre, vi è un crescente interesse per i sistemi TX-TL per la produzione di proteine ricombinanti di alto valore in un ambiente a reazione aperta2, ad esempio, per incorporare amminoacidi non standard nei coniugati anticorpo-farmaco3. In particolare, TX-TL richiede un estratto cellulare, plasmide o DNA lineare e una s....

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Protocol

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NOTA: vedere la Tabella 1 e la Tabella 2 per le ricette per GYM medium e piastra di agar e tamponi di lavaggio S30A e S30B.

1. Preparazione di soluzioni e linee guida generali

  1. Mantenere tutte le soluzioni, le cellule (post-crescita) e gli estratti cellulari sul ghiaccio dopo la preparazione, a meno che non venga indicata un'eccezione.
  2. Conservare le scorte per 1 M Mg-glutammato, 4 M K-glutammato, 40% (p/v) PEG 6000, 1 g/mL di acido polivinilsolfonico a temperatura ambiente e tutti gli altri stock a -80 °C. Ridurre al minimo il numero di cicli di congelamento-scongelamento per evitare la ....

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Results

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Questo protocollo dettagliato viene fornito come esempio per aiutare l'utente a stabilire un sistema Streptomyces TX-TL basato sul ceppo modello S. venezuelae ATCC 10712 (Figura 1). L'utente può cercare di studiare altri ceppi di Streptomyces; tuttavia, le fasi di crescita/raccolta di altri ceppi con tempi di raddoppio più lunghi o preferenze di crescita distinte dovranno essere ottimizzate su misura per ottenere risultati ottimali. Per il risultato rappresentativo.......

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Discussion

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In questo manoscritto, è stato descritto un protocollo S. venezuelae TX-TL ad alto rendimento con passaggi dettagliati che sono semplici da condurre sia per gli utenti esperti che per quelli nuovi dei sistemi TX-TL. Diverse caratteristiche dei protocolli Streptomyces45 ed E. coli TX-TL41 esistenti sono state rimosse per stabilire un protocollo minimo, ma ad alto rendimento per S. venezuelae TX-TL5,26.

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Disclosures

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgements

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Gli autori desiderano riconoscere il seguente supporto alla ricerca: EPSRC [EP/K038648/1] per SJM come PDRA con PSF; Wellcome Trust ha sponsorizzato la borsa di studio ISSF per SJM con PSF presso l'Imperial College di Londra; Borsa di ricerca della Royal Society [RGS\R1\191186]; Premio Wellcome Trust SEED [217528/Z/19/Z] per SJM presso l'Università del Kent; e Global Challenges Research Fund (GCRF) Ph.D. borsa di studio per KC presso l'Università del Kent.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Pallone UltraYield da 2,5 LThomson931136-B
3-PGA (>93%)SigmaP8877
Piastra inferiore a 384 pozzetti nero/trasparenteThermoFisher10692202
Cloruro di ammonio (98%)Fluorochem44722
ATP, CTP, UTP, GTP (soluzione 100 mM, >99%)ThermoFisherR0481
Carbenicillina (contattare il fornitore per la purezza)MelfordC46000-25.0
D-(+)-glucosio (contattare il fornitore per la purezza)MelfordG32040
DFHBI (≥ 98% - HPLC)SigmaSML1627
DTT (contattare il fornitore per la purezza)MelfordMB1015
FlAsH-EDT2 (contattare il fornitore per la purezza)Santa Cruz Biotechsc-363644
Glucosio-6-fosfato (>98%)SigmaG7879
HEPES Free Acid (contattare il fornitore per la purezza)MelfordB2001
Acido L-glutammico, sale di emimagnesio, tetraidrato (>98%)Sigma49605
cloruro di magnesio (98%)Fluorochem,494356
estratto di maltoSigma70167-500G
, PEG-6000Sigma807491
Pierce, piastra per microdialisi a 96 pozzetti, 10K MWCO,ThermoFisher88260
poli(vinile) sale di potassioSigma271969
Glutammato di potassio (>99%)SigmaG1149
RTS campionatore di aminoacidi5 Prime2401530
Cloruro di sodio (99%)Fluorochem94554
Supelclean LC-18 SPE C-18 colonna SPE (1 g)Sigma505471
Estratto di lievitoMelfordY1333
Equipment
PlatereaderBMGOmega
, , , ,

References

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  1. Carbonell, P., et al. An automated Design-Build-Test-Learn pipeline for enhanced microbial production of fine chemicals. Communications Biology. 1, 66(2018).
  2. Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis.

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Streptomyces Cell FreeTranscription TranslationSynthetic Biology ToolkitHigh GC GenesHeterologous ExpressionProtein SynthesisPlasmid ToolsetFluorescence StainingEnzyme PathwaysHigh Throughput Expression

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