JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Bioingegneria

Et streptomyces transkripsjonsoversettelsesverktøysett med høy avkastning for syntetisk biologi og naturlige produktapplikasjoner

Published: September 10, 2021
doi:
10.3791/63012
, , , ,
1Centre for Synthetic Biology and Innovation,South Kensington Campus, 2Department of Medicine,South Kensington Campus, 3Section of Structural and Synthetic Biology, Department of Infectious Disease,Imperial College London, 4Sir Alexander Fleming Building,South Kensington Campus, 5School of Biosciences, Division of Natural Sciences,University of Kent, 6UK Dementia Research Institute Care Research and Technology Centre,Imperial College London; Hammersmith Campus, 7UK Innovation and Knowledge Centre for Synthetic Biology (SynbiCITE) and the London Biofoundry,Imperial College Translation & Innovation Hub

Summary

Denne protokollen beskriver en forbedret metode for å syntetisere høye utbytter av rekombinante proteiner fra et Streptomyces venezuelae cellefri transkripsjon-oversettelsessystem (TX-TL).

Abstract

Streptomyces spp. er en viktig kilde til kliniske antibiotika og industrielle kjemikalier. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 er en raskt voksende stamme og en naturlig produsent av kloramfenikol, jadomycin og pikromycin, noe som gjør det til en attraktiv kandidat som neste generasjons syntetisk biologi chassis. Derfor er genetiske verktøy som akselererer utviklingen av S. venezuelae ATCC 10712, samt andre Streptomyces spp. modeller, svært ønskelige for naturlig produktteknikk og oppdagelse. For dette formål er et dedikert S. venezuelae ATCC 10712 cellefritt system gitt i denne protokollen for å muliggjøre høy avkastning heterologt uttrykk for høye G + C (%) gener. Denne protokollen er egnet for småskala (10-100 μL) batchreaksjoner i enten 96-brønns eller 384-brønns plateformat, mens reaksjoner er potensielt skalerbare. Det cellefrie systemet er robust og kan oppnå høye utbytter (~ 5-10 μ M) for en rekke rekombinante proteiner i et minimalt oppsett. Dette arbeidet inneholder også et bredt plasmidverktøysett for sanntidsmåling av mRNA og proteinsyntese, samt fluorescensfarging av taggede proteiner i gel. Denne protokollen kan også integreres med genuttrykkskarakteriseringsarbeidsflyter med høy gjennomstrømning eller studiet av enzymveier fra høye G+C-gener (%) som finnes i Actinomycetes-genomer.

Introduction

Cellefrie transkripsjonsoversettelsessystemer (TX-TL) gir en ideell prototypingsplattform for syntetisk biologi for å implementere raske design-bygg-test-læringssykluser, det konseptuelle ingeniørrammeverket for syntetisk biologi1. I tillegg er det økende interesse for TX-TL-systemer for høyverdig rekombinant proteinproduksjon i et miljø med åpen reaksjon2, for eksempel for å inkorporere ikke-standard aminosyrer i antistoff-medikamentkonjugater3. Spesielt krever TX-TL et celleekstrakt, plasmid eller lineært DNA, og en energiløsning for å katalysere proteinsyntese i batch eller semikontinentale reaksjoner. Mens Escherichia coli TX-TL er det dominerende cellefrie systemet, har en rekke nye TX-TL-systemer uten modell tiltrukket seg oppmerksomhet for forskjellige applikasjoner4,5,6,7,8. Viktige fordeler med TX-TL inkluderer fleksibel skalerbarhet (nanoliter til liter skala)9,10, sterk reproduserbarhet og automatiserte arbeidsflyter8,11,12. Spesielt tillater automatisering av TX-TL akselerert karakterisering av genetiske deler og regulatoriske elementer8,12,13.

Når det gjelder reaksjonsoppsett, krever TX-TL både primære og sekundære energikilder, samt aminosyrer, kofaktorer, tilsetningsstoffer og en mal-DNA-sekvens. Nukleotid tripfosfater (NTPer) gir den primære energikilden til å kjøre første mRNA (ATP, GTP, CTP og UTP) og proteinsyntese (bare ATP og GTP). For å øke TX-TL-utbyttet regenereres NTPer gjennom katabolismen til en sekundær energikilde, som maltose14, maltodextrin15, glukose14, 3-fosfoglyserat (3-PGA) 16, fosfoenolpyruvate17 og L-glutamat18. Denne iboende metabolske aktiviteten er overraskende allsidig, men likevel dårlig studert, spesielt i nye TX-TL-systemer. Hver energikilde har distinkte egenskaper og fordeler når det gjelder ATP-utbytte, kjemisk stabilitet og kostnad, noe som er et viktig hensyn for oppskalerte TX-TL-reaksjoner. Så langt har dagens protokoller for E. coli TX-TL nådd opptil 4,0 mg/ml (~157 μM) for modellen grønt fluorescerende protein (GFP), ved hjelp av en blanding på 3-PGA (30 mM), maltodextrin (60 mM) og D-ribose (30 mM) som sekundær energikilde19.

Nylig har det vært en økende interesse for å studere sekundære metabolitt biosyntetiske veier i TX-TL-systemer20,21,22. Spesielt er Actinobacteria en viktig kilde til sekundære metabolitter, inkludert antibiotika og landbrukskjemikalier23,24. Deres genomer er beriket med såkalte biosyntetiske genklynger (BGCs), som koder enzymatiske veier for sekundær metabolittbiosyntese. For studiet av Actinobacteria genetiske deler og biosyntetiske veier, har en rekke Streptomyces-baserte TX-TL-systemer nylig blitt utviklet5,6,25,26. Disse spesialiserte Streptomyces TX-TL-systemene er potensielt gunstige av følgende grunner: [1] levering av et innfødt proteinfoldingsmiljø for enzymer fra Streptomyces spp.26; [2] tilgang til et optimalt tRNA-basseng for høyt G+C (%)-genuttrykk; [3] aktiv primærmetabolisme, som potensielt kan kapres for tilførsel av biosyntetiske forløpere; og [4] levering av enzymer, forløpere eller kofaktorer fra sekundær metabolisme tilstede i det opprinnelige celleekstraktet. Derfor har det nylig blitt etablert et høyverdig S.venezuelae TX-TL-verktøysett for å utnytte disse unike egenskapene5.

Streptomyces venezuelae er en ny vert for syntetisk biologi med en rik historie innen industriell bioteknologi5,27,28,29 og som et modellsystem for å studere celledeling og genetisk regulering i Actinobacteria30,31,32. Hovedtypestammen, S. venezuelae ATCC 10712, har et relativt stort genom på 8,22 Mb med 72,5% G+C-innhold (%) (Tiltredelsesnummer: CP029197), som koder 7377 kodingssekvenser, 21 rRNAer, 67 tRNAer og 30 biosyntetiske genklynger27. I syntetisk biologi er S. venezuelae ATCC 10712 et attraktivt chassis for det heterografiske uttrykket av biosyntetiske veier. I motsetning til de fleste andre Streptomyces flekker, gir det flere viktige fordeler, inkludert en rask doblingstid (~ 40 min), et omfattende utvalg av genetiske og eksperimentelle verktøy5,28, mangel på mycelial klumping og sporulering i flytende medier28,33. Flere studier har også vist bruk av S. venezuelae for heterolog produksjon av et mangfoldig utvalg av sekundære metabolitter, inkludert polyketider, ribosomale og ikke-ibosomale peptider34,35,36,37,38. Disse kombinerte funksjonene gjør denne stammen til en attraktiv mikrobiell vert for syntetisk biologi og metabolske ingeniørapplikasjoner. Selv om S. venezuelae ikke er den dominerende Streptomyces-modellen for heterologt genuttrykk, med videre utvikling, er den klar for bredere bruk innen naturlig produktoppdagelse.

Dette manuskriptet presenterer en detaljert protokoll (figur 1) for et høy avkastning S. venezuelae TX-TL-system, som er oppdatert fra den opprinnelige tidligere publiserte protokollen26. I dette arbeidet er energiløsningen og reaksjonsforholdene optimalisert for å øke proteinutbyttet opp til 260 μg / ml for mScarlet-I reporterproteinet i en 4 h, 10 μL batchreaksjon, ved hjelp av en standard plasmid, pTU1-A-SP44-mScarlet-I. Denne plasmiden er spesielt designet for å muliggjøre ulike metoder for å oppdage proteinuttrykk. Protokollen er også strømlinjeformet, mens energisystemet er optimalisert for å redusere kompleksiteten og kostnadene ved å sette opp cellefrie reaksjoner uten at det går ut over utbyttet. Sammen med det optimaliserte TX-TL-systemet er det utviklet et bibliotek med genetiske deler for finjustering av genuttrykk og som fluorescerende verktøy for overvåking av TX-TL i sanntid, og skaper dermed en allsidig plattform for prototyping av genuttrykk og biosyntetiske veier av naturlig produkt fra Streptomyces spp. og relaterte Actinobacteria.

I dette arbeidet kan den anbefalte standard plasmid (pTU1-A-SP44-mScarlet-I) brukes til å etablere arbeidsflyten S. venezuelae TX-TL i et nytt laboratorium og er tilgjengelig på AddGene (se Supplerende tabell S1). pTU1-A-SP44-mScarlet-I gir brukeren fleksibilitet til å studere andre åpne leserammer (ORFer). mScarlet-I ORF er codon-optimalisert for S. Venezuelae genuttrykk. SP44-promotoren er en sterk konstituerende promotør som er svært aktiv i både E. coli og Streptomyces spp.39. Plasmiden har to unike begrensningsenzymsteder (NdeI, BamHI) for å tillate sub-kloning av nye ORFer i rammen med en felles C-terminal FLAG-tag og fluorescein arsenisk hårnål (FlAsH) bindemiddel tag system. Alternativt kan begge taggene fjernes med inkludering av en stoppkodon etter underkloning av et nytt gen. Med denne basevektoren har høyavkastningsuttrykket til en rekke proteiner blitt demonstrert, nemlig proteiner fra oxytetracycline biosyntesebanen og en ukarakterisert ikke-ibosomal peptidsyntetase (NRPS) fra Streptomyces rimosus (figur 2). Når det gjelder mRNA-deteksjon, inneholder pTU1-A-SP44-mScarlet-I standard plasmid en dBroccoli aptamer (i 3′-untranslated regionen) for deteksjon med 3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene imidazolinone (DFHBI) sonde. For økt fleksibilitet er et verktøysett med EcoFlex40-kompatible MoClo-deler også gjort tilgjengelig på AddGene, inkludert en EcoFlex-kompatibel Streptomyces shuttle vektor (pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP) og en rekke pTU1-A-SP44 variant plasmider som uttrykker superfolder grønt fluorescensprotein (sfGFP), mScarlet-I, mVenus-I og β-glucuronidase (GUS). Spesielt er pSF1C-A plasmid avledet fra pAV-gapdh28 og er herdet av BsaI / BsmBI-nettsteder for MoClo-montering. pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP tilsvarer pTU1-A-RFP/pTU2-A-RFP fra EcoFlex40, men inneholder tilleggsfunksjonalitet for konjugering og kromosommal integrasjon i Streptomyces spp. ved hjelp av phiC31 integrase-systemet28.

Den første fasen av protokollen innebærer veksten av S. venezuelae ATCC 10712 eller en nært beslektet stamme, cellehøsting i midteksponentiell fase, cellevasktrinn og likevekt i S30A- og S30B-buffere. Dette stadiet krever tre dager, og tiden for cellevekst kan brukes til å forberede de resterende komponentene som beskrevet nedenfor. De høstede cellene blir deretter lysnet av sonikering, avklart og gjennomgår en avrenningsreaksjon. På dette siste forberedelsesstadiet kan celleekstraktene fremstilles for langtidslagring ved -80 °C for å minimere tap av aktivitet. For montering av TX-TL-reaksjoner ved hjelp av denne protokollen presenteres en Streptomyces Master Mix (SMM), med mulighet for et minimalt energiløsningsformat (MES) som gir sammenlignbare utbytter. Videre anbefales det å strekke en frisk kultur av S. venezuelae ATCC 10712 fra en -80 ° C glyserol lager på en GYM agar plate og inkubere ved 28 ° C i minst 48-72 timer til enkle kolonier er synlige. Bare friske kulturer bør brukes til følgende trinn.

Protocol

MERK: Se tabell 1 og tabell 2 for oppskrifter på GYM medium og agarplate og S30A- og S30B vaskebuffere. 1. Utarbeidelse av løsninger og generell veiledning Behold alle løsninger, celler (etter vekst) og celleekstrakter på is etter tilberedning, med mindre det er oppgitt et unntak. Oppbevar lagre for 1 M Mg-glutamat, 4 M K-glutamat, 40% (w/v) PEG 6000, 1 g/ml polyvinylsulfonsyre ved romtemperatur og alle andre lagre ved -80 °C. Minimer…

Representative Results

Denne detaljerte protokollen er gitt som et eksempel for å hjelpe brukeren med å etablere et Streptomyces TX-TL-system basert på S. venezuelae ATCC 10712-modellstammen (figur 1). Brukeren kan søke å studere andre Streptomyces stammer; Vekst/høsting av andre stammer med lengre doblingstider eller distinkte vekstpreferanser må imidlertid optimaliseres for å oppnå toppresultater. For det representative resultatet ble mScarlet-I fluorescerende protein fra pTU1…

Discussion

I dette manuskriptet har en høyverdig TX-TL-protokoll blitt beskrevet med detaljerte trinn som er enkle å gjennomføre for både erfarne og nye brukere av TX-TL-systemer. Flere funksjoner fra eksisterende Streptomyces45– og E. coli TX-TL41-protokoller er fjernet for å etablere en minimal, men likevel høy avkastningsprotokoll for S. venezuelae TX-TL5,26. Arbeidsflyten som anbef…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne ønsker å anerkjenne følgende forskningsstøtte: EPSRC [EP/K038648/1] for SJM som en PDRA med PSF; Wellcome Trust sponset ISSF-stipend for SJM med PSF ved Imperial College London; Royal Society forskningsstipend [RGS\R1\191186]; Wellcome Trust SEED-prisen [217528/Z/19/Z] for SJM ved University of Kent; og Global Challenges Research Fund (GCRF) Ph.D. stipend for KC ved University of Kent.

Materials

2.5 L UltraYield Flask Thomson 931136-B
3-PGA (>93%) Sigma P8877
384 Well Black/Clear Bottom Plate ThermoFisher 10692202
Ammonium chloride (98%) Fluorochem 44722
ATP, CTP, UTP, GTP (100 mM solution, >99%) ThermoFisher R0481
Carbenicillin (contact supplier for purity) Melford C46000-25.0
D-(+)-glucose (contact supplier for purity) Melford G32040
DFHBI (≥98% – HPLC) Sigma SML1627
DTT (contact supplier for purity) Melford MB1015
FlAsH-EDT2 (contact supplier for purity) Santa Cruz Biotech sc-363644
Glucose-6-phosphate (>98%) Sigma G7879
HEPES Free Acid (contact supplier for purity) Melford B2001
L-glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate (>98%) Sigma 49605
Magnesium chloride (98%) Fluorochem 494356
Malt extract Sigma 70167-500G
PEG-6000 Sigma 807491
Pierce 96-well Microdialysis Plate, 10K MWCO ThermoFisher 88260
Poly(vinyl sulfate) potassium salt Sigma 271969
Potassium glutamate (>99%) Sigma G1149
RTS amino acid sampler 5 Prime 2401530
Sodium chloride (99%) Fluorochem 94554
Supelclean LC-18 SPE C-18 SPE column (1 g) Sigma 505471
Yeast Extract Melford Y1333
Equipment
Platereader BMG Omega
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Carbonell, P., et al. An automated Design-Build-Test-Learn pipeline for enhanced microbial production of fine chemicals. Communications Biology. 1, 66 (2018).
  2. Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user’s guide to cell-free protein synthesis. Methods Protocols. 2 (1), 24 (2019).
  3. Zimmerman, E. S., et al. Production of site-specific antibody-drug conjugates using optimized non-natural amino acids in a cell-free expression system. Bioconjugate Chemistry. 25 (2), 351-361 (2014).
  4. Wiegand, D. J., Lee, H. H., Ostrov, N., Church, G. M. Cell-free protein expression using the rapidly growing bacterium Vibrio natriegens. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), e59495 (2019).
  5. Moore, S. J., et al. A Streptomyces venezuelae cell-free toolkit for synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 10 (2), 402-411 (2021).
  6. Xu, H., Liu, W. -. Q., Li, J. Translation related factors improve the productivity of a Streptomyces-based cell-free protein synthesis system. ACS Synthetic Biology. 9 (5), 1221-1224 (2020).
  7. Yim, S. S., et al. Multiplex transcriptional characterizations across diverse bacterial species using cell-free systems. Molecular Systems Biology. 15 (8), 8875 (2019).
  8. Moore, S. J., et al. Rapid acquisition and model-based analysis of cell-free transcription-translation reactions from nonmodel bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4340-4349 (2018).
  9. Zawada, J. F., et al. Microscale to manufacturing scale-up of cell-free cytokine production–a new approach for shortening protein production development timelines. Biotechnology and Bioengineering. 108 (7), 1570-1578 (2011).
  10. Geertz, M., Shore, D., Maerkl, S. J. Massively parallel measurements of molecular interaction kinetics on a microfluidic platform. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (41), 16540-16545 (2012).
  11. McManus, J. B., Emanuel, P. A., Murray, R. M., Lux, M. W. A method for cost-effective and rapid characterization of engineered T7-based transcription factors by cell-free protein synthesis reveals insights into the regulation of T7 RNA polymerase-driven expression. Archives of Biochemistry and Biophysics. 674, 108045 (2019).
  12. McManus, J. B., et al. A method for cost-effective and rapid characterization of genetic parts. bioRxiv. , (2021).
  13. Park, J., Yim, S. S., Wang, H. H. High-throughput transcriptional characterization of regulatory sequences from bacterial Biosynthetic Gene Clusters. ACS Synthetic Biology. , (2021).
  14. Caschera, F., Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie. 99, 162-168 (2014).
  15. Caschera, F., Noireaux, V. A cost-effective polyphosphate-based metabolism fuels an all E. coli cell-free expression system. Metabolic Engineering. 27, 29-37 (2015).
  16. Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4, 8 (2010).
  17. Karim, A. S., Heggestad, J. T., Crowe, S. A., Jewett, M. C. Controlling cell-free metabolism through physiochemical perturbations. Metabolic Engineering. 45, 86-94 (2018).
  18. Cai, Q., et al. A simplified and robust protocol for immunoglobulin expression in Escherichia coli cell-free protein synthesis systems. Biotechnology Progress. 31 (3), 823-831 (2015).
  19. Garenne, D., Thompson, S., Brisson, A., Khakimzhan, A., Noireaux, V. The all-E. coli TXTL toolbox 3.0: New capabilities of a cell-free synthetic biology platform. Synthetic Biology. , (2021).
  20. Goering, A. W., et al. In vitro reconstruction of nonribosomal peptide biosynthesis directly from DNA using cell-free protein synthesis. ACS Synthetic Biology. 6 (1), 39-44 (2017).
  21. Khatri, Y., et al. Multicomponent microscale biosynthesis of unnatural cyanobacterial indole alkaloids. ACS Synthetic Biology. 9 (6), 1349-1360 (2020).
  22. Zhuang, L., et al. Total in vitro biosynthesis of the nonribosomal macrolactone peptide valinomycin. Metabolic Engineering. 60, 37-44 (2020).
  23. Hoskisson, P. A., Seipke, R. F. Cryptic or silent? The known unknowns, unknown knowns, and unknown unknowns of secondary metabolism. mBio. 11 (5), 02642 (2020).
  24. Bentley, S. D., et al. Complete genome sequence of the model actinomycete Streptomyces coelicolor A3(2). Nature. 417 (6885), 141-147 (2002).
  25. Li, J., Wang, H., Kwon, Y. -. C., Jewett, M. C. Establishing a high yielding Streptomyces-based cell-free protein synthesis system. Biotechnology and Bioengineering. 114 (6), 1343-1353 (2017).
  26. Moore, S. J., Lai, H. -. E., Needham, H., Polizzi, K. M., Freemont, P. S. Streptomyces venezuelae TX-TL – a next generation cell-free synthetic biology tool. Biotechnology Journal. 12 (4), (2017).
  27. Kim, W., et al. Comparative genomics determines strain-dependent secondary metabolite production in Streptomyces venezuelae strains. Biomolecules. 10 (6), 864 (2020).
  28. Phelan, R. M., et al. Development of next generation synthetic biology tools for use in Streptomyces venezuelae. ACS Synthetic Biology. 6 (1), 159-166 (2017).
  29. Song, J. Y., et al. Complete genome sequence of Streptomyces venezuelae ATCC 15439, a promising cell factory for production of secondary metabolites. Journal of Biotechnology. 219, 57-58 (2016).
  30. Bush, M. J., Bibb, M. J., Chandra, G., Findlay, K. C., Buttner, M. J. Genes required for aerial growth, cell division, and chromosome segregation are targets of WhiA before sporulation in Streptomyces venezuelae. mBio. 4 (5), 00684 (2013).
  31. Schumacher, M. A., et al. The crystal structure of the RsbN-σBldN complex from Streptomyces venezuelae defines a new structural class of anti-σ factor. Nucleic Acids Research. 46 (14), 7405-7417 (2018).
  32. Ramos-León, F., et al. A conserved cell division protein directly regulates FtsZ dynamics in filamentous and unicellular actinobacteria. Elife. 10, 63387 (2021).
  33. Bush, M. J., Tschowri, N., Schlimpert, S., Flärdh, K., Buttner, M. J. c-di-GMP signalling and the regulation of developmental transitions in Streptomycetes. Nature Reviews. Microbiology. 13 (12), 749-760 (2015).
  34. Ehrlich, J., Gottlieb, D., Burkholder, P. R., Anderson, L. E., Pridham, T. G. Streptomyces venezuelae, n. sp., the source of chloromycetin. Journal of Bacteriology. 56 (4), 467-477 (1948).
  35. Inahashi, Y., et al. Watasemycin biosynthesis in Streptomyces venezuelae: thiazoline C-methylation by a type B radical-SAM methylase homologue. Chemical Science. 8 (4), 2823-2831 (2017).
  36. Jakeman, D. L., et al. Antimicrobial activities of jadomycin B and structurally related analogues. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (3), 1245-1247 (2009).
  37. Kodani, S., Sato, K., Hemmi, H., Ohnish-Kameyama, M. Isolation and structural determination of a new hydrophobic peptide venepeptide from Streptomyces venezuelae. Journal of Antibiotics. 67 (12), 839-842 (2014).
  38. Akey, D. L., et al. Structural basis for macrolactonization by the pikromycin thioesterase. Nature Chemical Biology. 2 (10), 537-542 (2006).
  39. Bai, C., et al. Exploiting a precise design of universal synthetic modular regulatory elements to unlock the microbial natural products in Streptomyces. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (39), 12181-12186 (2015).
  40. Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
  41. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50762 (2013).
  42. Kim, D. M., Choi, C. Y. A semicontinuous prokaryotic coupled transcription/translation system using a dialysis membrane. Biotechnology Progress. 12 (5), 645-649 (1996).
  43. Liu, Y., Fritz, B. R., Anderson, M. J., Schoborg, J. A., Jewett, M. C. Characterizing and alleviating substrate limitations for improved in vitro ribosome construction. ACS Synthetic Biology. 4 (4), 454-462 (2015).
  44. Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nature Methods. 14, 53-56 (2017).
  45. Hopword, D. A., Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K. Practical Streptomyces genetics. John Innes Foundation. , (2000).
  46. Hunter, D. J. B., Bhumkar, A., Giles, N., Sierecki, E., Gambin, Y. Unexpected instabilities explain batch-to-batch variability in cell-free protein expression systems. Biotechnology and Bioengineering. 115 (8), 1904-1914 (2018).
  47. Dopp, J. L., Jo, Y. R., Reuel, N. F. Methods to reduce variability in E. coli-based cell-free protein expression experiments. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
  48. Hoff, G., Bertrand, C., Piotrowski, E., Thibessard, A., Leblond, P. Genome plasticity is governed by double strand break DNA repair in Streptomyces. Scientific Reports. 8, 5272 (2018).
  49. Bibb, M. J. Regulation of secondary metabolism in streptomycetes. Current Opinion in Microbiology. 8 (2), 208-215 (2005).
  50. Weber, T., et al. antiSMASH 3.0-a comprehensive resource for the genome mining of biosynthetic gene clusters. Nucleic Acids Research. 43 (1), 237-243 (2015).
  51. Navarro-Muñoz, J. C., et al. A computational framework to explore large-scale biosynthetic diversity. Nature Chemical Biology. 16, 60-68 (2020).
  52. Alanjary, M., et al. The Antibiotic Resistant Target Seeker (ARTS), an exploration engine for antibiotic cluster prioritization and novel drug target discovery. Nucleic Acids Research. 45 (1), 42-48 (2017).
  53. Medema, M. H., Fischbach, M. A. Computational approaches to natural product discovery. Nature Chemical Biology. 11 (9), 639-648 (2015).
  54. Whitford, C. M., Cruz-Morales, P., Keasling, J. D., Weber, T. The Design-Build-Test-Learn cycle for metabolic engineering of Streptomycetes. Essays in Biochemistry. , (2021).

Tags

Keywords: Streptomyces VenezuelaeCell-free Transcription-translationHigh GC ContentMetabolic EnzymesBiosynthetic PathwaysHeterologous ExpressionS30A BufferS30B BufferDithiothreitol (DTT)SonicationCrude ExtractsNon-model OrganismSynthetic BiologyNatural Product Applications
check_url/it/63012?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Toh, M., Chengan, K., Hanson, T., Freemont, P. S., Moore, S. J. A High-Yield Streptomyces Transcription-Translation Toolkit for Synthetic Biology and Natural Product Applications. J. Vis. Exp. (175), e63012, doi:10.3791/63012 (2021).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image