En högavkastande Streptomyces Transcription-Translation Toolkit för syntetisk biologi och naturliga produktapplikationer
Summary
Detta protokoll beskriver en förbättrad metod för att syntetisera höga utbyten av rekombinanta proteiner från ett Streptomyces venezuelae cell-free transcription-translation (TX-TL) system.
Abstract
är en stor källa till kliniska antibiotika och industrikemikalier. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 är en snabbväxande stam och en naturlig tillverkare av kloramfenicol, jadomycin och pikromycin, vilket gör det till en attraktiv kandidat som nästa generations syntetiska biologichassi. Därför är genetiska verktyg som påskyndar utvecklingen av S. venezuelae ATCC 10712, liksom andra Streptomyces spp. modeller, mycket önskvärda för naturlig produktteknik och upptäckt. För detta ändamål tillhandahålls ett dedikerat S. venezuelae ATCC 10712 cellfritt system i detta protokoll för att möjliggöra högavkastande heterologous uttryck av höga G +C (%) gener. Detta protokoll är lämpligt för småskaliga (10-100 μL) batchreaktioner i antingen 96-brunns- eller 384-brunnsplåtformat, medan reaktioner är potentiellt skalbara. Det cellfria systemet är robust och kan uppnå hög avkastning (~ 5-10 μ M) för en rad rekombinanta proteiner i en minimal installation. Detta arbete innehåller också en bred plasmidverktygsuppsättning för realtidsmätning av mRNA och proteinsyntes, samt fluorescensfärgning i gel av märkta proteiner. Detta protokoll kan också integreras med arbetsflöden för hög genomströmning genuttryck karakterisering eller studiet av enzymvägar från höga G +C (%) gener som finns i Actinomycetes genom.
Introduction
Cellfria TX-TL-system (Transcription-Translation) ger en idealisk prototypplattform för syntetisk biologi för att implementera snabba design-build-test-learn-cykler, det konceptuella tekniska ramverket för syntetisk biologi1. Dessutom finns det ett växande intresse för TX-TL-system för högvärdig rekombinant proteinproduktion i en öppen reaktionsmiljö2, till exempel för att införliva icke-standardiserade aminosyror i antikroppsläkemedelskonjugat3. Specifikt kräver TX-TL ett cellextrakt, plasmid eller linjärt DNA, och en energilösning för att katalysera proteinsyntesen i batch- eller halvkontinentala reaktioner. Medan Escherichia coli TX-TL är det dominerande cellfria systemet, har ett antal framväxande icke-modell TX-TL-system uppmärksammats för olika applikationer4,5,6,7,8. Viktiga fördelar med TX-TL inkluderar flexibel skalbarhet (nanoliter till literskala) 9,10, stark reproducerbarhet och automatiserade arbetsflöden8,11,12. I synnerhet tillåter automatisering av TX-TL en accelererad karakterisering av genetiska delar och regleringselement8,12,13.
När det gäller reaktionsinställning kräver TX-TL både primära och sekundära energikällor, liksom aminosyror, kofaktorer, tillsatser och en mall-DNA-sekvens. Nukleotidtrifosfater (NTP) ger den primära energikällan för att driva initial mRNA (ATP, GTP, CTP och UTP) och proteinsyntes (endast ATP och GTP). För att öka TX-TL-avkastningen regenereras NTPs genom katabolism hos en sekundär energikälla, såsom maltose14, maltodextrin15, glukos14, 3-fosfolycerat (3-PGA)16, phosphoenolpyruvate17 och L-glutamat18. Denna inneboende metaboliska aktivitet är förvånansvärt mångsidig, men ändå dåligt studerade, särskilt i framväxande TX-TL-system. Varje energikälla har distinkta egenskaper och fördelar när det gäller ATP-utbyte, kemisk stabilitet och kostnad, vilket är en viktig faktor för uppskalade TX-TL-reaktioner. Hittills har nuvarande protokoll för E. coli TX-TL nått upp till 4,0 mg/mL (~157 μM) för modellen grönt fluorescerande protein (GFP), med en blandning av 3-PGA (30 mM), maltodextrin (60 mM) och D-ribos (30 mM) som sekundär energikälla19.
Nyligen har det funnits ett ökande intresse för att studera sekundära metabolitbiosyntetiska vägar i TX-TL-system20,21,22. Specifikt är Actinobacteria en viktig källa till sekundära metaboliter, inklusive antibiotika och jordbrukskemikalier23,24. Deras genom berikas med så kallade biosyntetiska genkluster (BGCs), som kodar enzymatiska vägar för sekundär metabolitbiosyntes. För studier av Actinobacteria genetiska delar och biosyntetiska vägar har en rad Streptomyces-baserade TX-TL-system nyligen utvecklats5,6,25,26. Dessa specialiserade Streptomyces TX-TL-system är potentiellt fördelaktiga av följande skäl: [1] tillhandahållande av en inhemsk proteinveckningsmiljö för enzymer från Streptomyces spp.26; [2] tillgång till en optimal tRNA-pool för högt G+C (%) genuttryck; [3] aktiv primärmetabolism, som potentiellt kan kapas för leverans av biosyntetiska prekursorer; och [4] tillhandahållande av enzymer, prekursorer eller kofaktorer från sekundär metabolism som finns i det ursprungliga cellextraktet. Därför har en högavkastande S.venezuelae TX-TL-verktygslåda nyligen inrättats för att utnyttja dessa unika funktioner5.
Streptomyces venezuelae är en framväxande värd för syntetisk biologi med en rik historia inom industriell bioteknik5,27,28,29 och som ett modellsystem för att studera celldelning och genetisk reglering i Actinobacteria30,31,32. Huvudtypstammen, S. venezuelae ATCC 10712, har ett relativt stort genom på 8,22 Mb med 72,5% G +C-innehåll (%) (Anslutningsnummer: CP029197), som kodar 7377 kodningssekvenser, 21 rRNAs, 67 tRNAs och 30 biosyntetiska genkluster27. Inom syntetisk biologi är S. venezuelae ATCC 10712 ett attraktivt chassi för heterologt uttryck för biosyntetiska vägar. Till skillnad från de flesta andra Streptomyces fläckar ger det flera viktiga fördelar, inklusive en snabb fördubblingstid (~ 40 min), ett omfattande utbud av genetiska och experimentella verktyg5,28, brist på mycelial klumpning och sporulering i flytande medier28,33. Flera studier har också visat användningen av S. venezuelae för heterolog produktion av en mängd olika sekundära metaboliter, inklusive polyketider, ribosomala och nonribosomala peptider34,35,36,37,38. Dessa kombinerade funktioner gör denna stam en attraktiv mikrobiell värd för syntetisk biologi och metaboliska tekniska tillämpningar. Medan S. venezuelae inte är den dominerande Streptomyces-modellen för heterologa genuttryck, med ytterligare utveckling, är den primad för bredare användning inom naturlig produktupptäckt.
Detta manuskript presenterar ett detaljerat protokoll (figur 1) för ett högavkastande S. venezuelae TX-TL-system, som har uppdaterats från det ursprungliga tidigare publicerade protokollet26. I detta arbete har energilösningen och reaktionsförhållandena optimerats för att öka proteinutbytet upp till 260 μg/ml för mScarlet-I reporterproteinet i en 4 h, 10 μL batchreaktion, med hjälp av en standardplasmid, pTU1-A-SP44-mScarlet-I. Denna plasmid har utformats speciellt för att möjliggöra olika metoder för att upptäcka proteinuttryck. Protokollet är också strömlinjeformat, medan energisystemet har optimerats för att minska komplexiteten och kostnaden för att ställa in cellfria reaktioner utan att kompromissa med utbytet. Tillsammans med det optimerade TX-TL-systemet har ett bibliotek med genetiska delar utvecklats för finjustering av genuttryck och som fluorescerande verktyg för övervakning av TX-TL i realtid, vilket skapar en mångsidig plattform för prototyper av genuttryck och biosyntetiska vägar från Streptomyces spp. och relaterade Actinobakterier.
I detta arbete kan den rekommenderade standardplasmiden (pTU1-A-SP44-mScarlet-I) användas för att upprätta S. venezuelae TX-TL-arbetsflödet i ett nytt laboratorium och finns tillgängligt på AddGene (se Kompletterande tabell S1). pTU1-A-SP44-mScarlet-I ger användaren flexibiliteten att studera andra öppna läsramar (ORFs). mScarlet-I ORF är kodonoptimerad för S. venezuelae genuttryck. SP44-promotorn är en stark konstituerande promotor som är mycket aktiv i både E. coli och Streptomyces spp.39. Plasmiden har två unika restriktionsenzymplatser (NdeI, BamHI) för att tillåta underkloring av nya ORFs i ramen med en gemensam C-terminal FLAG-tag och fluorescein arsenik hårnål (FlAsH) binder tag system. Alternativt kan båda taggarna tas bort med införandet av en stop codon efter subkloning av en ny gen. Med denna basvektor har högavkastande uttryck av en rad proteiner påvisats, nämligen proteiner från oxytetracycline biosyntes utbildningsavsnittet och en okarakteriserad nonribosomal peptidsynthetas (NRPS) från Streptomyces rimosus (figur 2). När det gäller mRNA-detektion innehåller pTU1-A-SP44-mScarlet-I standardplasmid en dBroccoli aptamer (i 3′-untranslated regionen) för detektion med 3,5-difluoro-4-hydroxybenzyliden imidazolinone (DFHBI) sonden. För ökad flexibilitet har en verktygsuppsättning av EcoFlex40-kompatibla MoClo-delar också gjorts tillgänglig på AddGene, inklusive en EcoFlex-kompatibel Streptomyces shuttle vektor (pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP) och en rad pTU1-A-SP44 variantplasmider som uttrycker superfolder grönt fluorescensprotein (sfGFP), mScarlet-I, mVenus-I, mVenus-I, och β- PSF1C-A-plasmiden kommer i synnerhet från pAV-gapdh28 och härdas av BsaI/BsmBI-platser för MoClo-montering. pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP motsvarar pTU1-A-RFP/pTU2-A-RFP från EcoFlex40 men innehåller ytterligare funktionalitet för konjugation och kromosomintegration i Streptomyces spp. med hjälp av phiC31 integrase system28.
Det första steget i protokollet innebär tillväxt av S. venezuelae ATCC 10712 eller en närbesläktad stam, cellskörd i mitten av exponentiell fas, celltvättsteg och jämvikt i S30A- och S30B-buffertar. Detta steg kräver tre dagar, och tiden för celltillväxt kan användas för att förbereda de återstående komponenterna enligt beskrivningen nedan. De skördade cellerna lyseras sedan av ultraljudsbehandling, förtydligas och genomgår en avrinningsreaktion. I detta sista steg av beredningen kan cellextrakten förberedas för långtidslagring vid -80 °C för att minimera förlust av aktivitet. För montering av TX-TL-reaktioner med detta protokoll presenteras en Streptomyces Master Mix (SMM), med möjlighet till ett MINIMAL Energy Solution-format (MES) som ger jämförbara utbyten. Vidare rekommenderas att strimla en ny kultur av S. venezuelae ATCC 10712 från ett -80 °C glycerolbuljong på en GYM-agarplatta och inkubera vid 28 °C i minst 48-72 h tills enskilda kolonier är synliga. Endast nya kulturer bör användas för följande steg.
Protocol
Representative Results
Discussion
I detta manuskript har ett högavkastande S. venezuelae TX-TL-protokoll beskrivits med detaljerade steg som är enkla att genomföra för både erfarna och nya användare av TX-TL-system. Flera funktioner från befintliga Streptomyces45– och E. coli TX-TL41-protokoll har tagits bort för att upprätta ett minimalt, men ändå high-yield protokoll för S. venezuelae TX-TL5,26. Arbe…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill erkänna följande forskningsstöd: EPSRC [EP/K038648/1] för SJM som PDRA med polyesterstapelfibrer; Wellcome Trust sponsrade ISSF-stipendium för SJM med PSF vid Imperial College London; Royal Society forskningsanslag [RGS\R1\191186]; Wellcome Förtroende KÄRNAR UR UTMÄRKELSE [217528/Z/19/Z] för SJM på universitetar av Kent; och Global Challenges Research Fund (GCRF) Doktorandstipendium för KC vid University of Kent.
Materials
| 2.5 L UltraYield Flask | Thomson | 931136-B | |
| 3-PGA (>93%) | Sigma | P8877 | |
| 384 Well Black/Clear Bottom Plate | ThermoFisher | 10692202 | |
| Ammonium chloride (98%) | Fluorochem | 44722 | |
| ATP, CTP, UTP, GTP (100 mM solution, >99%) | ThermoFisher | R0481 | |
| Carbenicillin (contact supplier for purity) | Melford | C46000-25.0 | |
| D-(+)-glucose (contact supplier for purity) | Melford | G32040 | |
| DFHBI (≥98% – HPLC) | Sigma | SML1627 | |
| DTT (contact supplier for purity) | Melford | MB1015 | |
| FlAsH-EDT2 (contact supplier for purity) | Santa Cruz Biotech | sc-363644 | |
| Glucose-6-phosphate (>98%) | Sigma | G7879 | |
| HEPES Free Acid (contact supplier for purity) | Melford | B2001 | |
| L-glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate (>98%) | Sigma | 49605 | |
| Magnesium chloride (98%) | Fluorochem | 494356 | |
| Malt extract | Sigma | 70167-500G | |
| PEG-6000 | Sigma | 807491 | |
| Pierce 96-well Microdialysis Plate, 10K MWCO | ThermoFisher | 88260 | |
| Poly(vinyl sulfate) potassium salt | Sigma | 271969 | |
| Potassium glutamate (>99%) | Sigma | G1149 | |
| RTS amino acid sampler | 5 Prime | 2401530 | |
| Sodium chloride (99%) | Fluorochem | 94554 | |
| Supelclean LC-18 SPE C-18 SPE column (1 g) | Sigma | 505471 | |
| Yeast Extract | Melford | Y1333 | |
| Equipment | |||
| Platereader | BMG | Omega |
Riferimenti
- Carbonell, P., et al. An automated Design-Build-Test-Learn pipeline for enhanced microbial production of fine chemicals. Communications Biology. 1, 66 (2018).
- Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user’s guide to cell-free protein synthesis. Methods Protocols. 2 (1), 24 (2019).
- Zimmerman, E. S., et al. Production of site-specific antibody-drug conjugates using optimized non-natural amino acids in a cell-free expression system. Bioconjugate Chemistry. 25 (2), 351-361 (2014).
- Wiegand, D. J., Lee, H. H., Ostrov, N., Church, G. M. Cell-free protein expression using the rapidly growing bacterium Vibrio natriegens. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), e59495 (2019).
- Moore, S. J., et al. A Streptomyces venezuelae cell-free toolkit for synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 10 (2), 402-411 (2021).
- Xu, H., Liu, W. -. Q., Li, J. Translation related factors improve the productivity of a Streptomyces-based cell-free protein synthesis system. ACS Synthetic Biology. 9 (5), 1221-1224 (2020).
- Yim, S. S., et al. Multiplex transcriptional characterizations across diverse bacterial species using cell-free systems. Molecular Systems Biology. 15 (8), 8875 (2019).
- Moore, S. J., et al. Rapid acquisition and model-based analysis of cell-free transcription-translation reactions from nonmodel bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4340-4349 (2018).
- Zawada, J. F., et al. Microscale to manufacturing scale-up of cell-free cytokine production–a new approach for shortening protein production development timelines. Biotechnology and Bioengineering. 108 (7), 1570-1578 (2011).
- Geertz, M., Shore, D., Maerkl, S. J. Massively parallel measurements of molecular interaction kinetics on a microfluidic platform. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (41), 16540-16545 (2012).
- McManus, J. B., Emanuel, P. A., Murray, R. M., Lux, M. W. A method for cost-effective and rapid characterization of engineered T7-based transcription factors by cell-free protein synthesis reveals insights into the regulation of T7 RNA polymerase-driven expression. Archives of Biochemistry and Biophysics. 674, 108045 (2019).
- McManus, J. B., et al. A method for cost-effective and rapid characterization of genetic parts. bioRxiv. , (2021).
- Park, J., Yim, S. S., Wang, H. H. High-throughput transcriptional characterization of regulatory sequences from bacterial Biosynthetic Gene Clusters. ACS Synthetic Biology. , (2021).
- Caschera, F., Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie. 99, 162-168 (2014).
- Caschera, F., Noireaux, V. A cost-effective polyphosphate-based metabolism fuels an all E. coli cell-free expression system. Metabolic Engineering. 27, 29-37 (2015).
- Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4, 8 (2010).
- Karim, A. S., Heggestad, J. T., Crowe, S. A., Jewett, M. C. Controlling cell-free metabolism through physiochemical perturbations. Metabolic Engineering. 45, 86-94 (2018).
- Cai, Q., et al. A simplified and robust protocol for immunoglobulin expression in Escherichia coli cell-free protein synthesis systems. Biotechnology Progress. 31 (3), 823-831 (2015).
- Garenne, D., Thompson, S., Brisson, A., Khakimzhan, A., Noireaux, V. The all-E. coli TXTL toolbox 3.0: New capabilities of a cell-free synthetic biology platform. Synthetic Biology. , (2021).
- Goering, A. W., et al. In vitro reconstruction of nonribosomal peptide biosynthesis directly from DNA using cell-free protein synthesis. ACS Synthetic Biology. 6 (1), 39-44 (2017).
- Khatri, Y., et al. Multicomponent microscale biosynthesis of unnatural cyanobacterial indole alkaloids. ACS Synthetic Biology. 9 (6), 1349-1360 (2020).
- Zhuang, L., et al. Total in vitro biosynthesis of the nonribosomal macrolactone peptide valinomycin. Metabolic Engineering. 60, 37-44 (2020).
- Hoskisson, P. A., Seipke, R. F. Cryptic or silent? The known unknowns, unknown knowns, and unknown unknowns of secondary metabolism. mBio. 11 (5), 02642 (2020).
- Bentley, S. D., et al. Complete genome sequence of the model actinomycete Streptomyces coelicolor A3(2). Nature. 417 (6885), 141-147 (2002).
- Li, J., Wang, H., Kwon, Y. -. C., Jewett, M. C. Establishing a high yielding Streptomyces-based cell-free protein synthesis system. Biotechnology and Bioengineering. 114 (6), 1343-1353 (2017).
- Moore, S. J., Lai, H. -. E., Needham, H., Polizzi, K. M., Freemont, P. S. Streptomyces venezuelae TX-TL – a next generation cell-free synthetic biology tool. Biotechnology Journal. 12 (4), (2017).
- Kim, W., et al. Comparative genomics determines strain-dependent secondary metabolite production in Streptomyces venezuelae strains. Biomolecules. 10 (6), 864 (2020).
- Phelan, R. M., et al. Development of next generation synthetic biology tools for use in Streptomyces venezuelae. ACS Synthetic Biology. 6 (1), 159-166 (2017).
- Song, J. Y., et al. Complete genome sequence of Streptomyces venezuelae ATCC 15439, a promising cell factory for production of secondary metabolites. Journal of Biotechnology. 219, 57-58 (2016).
- Bush, M. J., Bibb, M. J., Chandra, G., Findlay, K. C., Buttner, M. J. Genes required for aerial growth, cell division, and chromosome segregation are targets of WhiA before sporulation in Streptomyces venezuelae. mBio. 4 (5), 00684 (2013).
- Schumacher, M. A., et al. The crystal structure of the RsbN-σBldN complex from Streptomyces venezuelae defines a new structural class of anti-σ factor. Nucleic Acids Research. 46 (14), 7405-7417 (2018).
- Ramos-León, F., et al. A conserved cell division protein directly regulates FtsZ dynamics in filamentous and unicellular actinobacteria. Elife. 10, 63387 (2021).
- Bush, M. J., Tschowri, N., Schlimpert, S., Flärdh, K., Buttner, M. J. c-di-GMP signalling and the regulation of developmental transitions in Streptomycetes. Nature Reviews. Microbiology. 13 (12), 749-760 (2015).
- Ehrlich, J., Gottlieb, D., Burkholder, P. R., Anderson, L. E., Pridham, T. G. Streptomyces venezuelae, n. sp., the source of chloromycetin. Journal of Bacteriology. 56 (4), 467-477 (1948).
- Inahashi, Y., et al. Watasemycin biosynthesis in Streptomyces venezuelae: thiazoline C-methylation by a type B radical-SAM methylase homologue. Chemical Science. 8 (4), 2823-2831 (2017).
- Jakeman, D. L., et al. Antimicrobial activities of jadomycin B and structurally related analogues. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (3), 1245-1247 (2009).
- Kodani, S., Sato, K., Hemmi, H., Ohnish-Kameyama, M. Isolation and structural determination of a new hydrophobic peptide venepeptide from Streptomyces venezuelae. Journal of Antibiotics. 67 (12), 839-842 (2014).
- Akey, D. L., et al. Structural basis for macrolactonization by the pikromycin thioesterase. Nature Chemical Biology. 2 (10), 537-542 (2006).
- Bai, C., et al. Exploiting a precise design of universal synthetic modular regulatory elements to unlock the microbial natural products in Streptomyces. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (39), 12181-12186 (2015).
- Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50762 (2013).
- Kim, D. M., Choi, C. Y. A semicontinuous prokaryotic coupled transcription/translation system using a dialysis membrane. Biotechnology Progress. 12 (5), 645-649 (1996).
- Liu, Y., Fritz, B. R., Anderson, M. J., Schoborg, J. A., Jewett, M. C. Characterizing and alleviating substrate limitations for improved in vitro ribosome construction. ACS Synthetic Biology. 4 (4), 454-462 (2015).
- Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nature Methods. 14, 53-56 (2017).
- Hopword, D. A., Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K. Practical Streptomyces genetics. John Innes Foundation. , (2000).
- Hunter, D. J. B., Bhumkar, A., Giles, N., Sierecki, E., Gambin, Y. Unexpected instabilities explain batch-to-batch variability in cell-free protein expression systems. Biotechnology and Bioengineering. 115 (8), 1904-1914 (2018).
- Dopp, J. L., Jo, Y. R., Reuel, N. F. Methods to reduce variability in E. coli-based cell-free protein expression experiments. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
- Hoff, G., Bertrand, C., Piotrowski, E., Thibessard, A., Leblond, P. Genome plasticity is governed by double strand break DNA repair in Streptomyces. Scientific Reports. 8, 5272 (2018).
- Bibb, M. J. Regulation of secondary metabolism in streptomycetes. Current Opinion in Microbiology. 8 (2), 208-215 (2005).
- Weber, T., et al. antiSMASH 3.0-a comprehensive resource for the genome mining of biosynthetic gene clusters. Nucleic Acids Research. 43 (1), 237-243 (2015).
- Navarro-Muñoz, J. C., et al. A computational framework to explore large-scale biosynthetic diversity. Nature Chemical Biology. 16, 60-68 (2020).
- Alanjary, M., et al. The Antibiotic Resistant Target Seeker (ARTS), an exploration engine for antibiotic cluster prioritization and novel drug target discovery. Nucleic Acids Research. 45 (1), 42-48 (2017).
- Medema, M. H., Fischbach, M. A. Computational approaches to natural product discovery. Nature Chemical Biology. 11 (9), 639-648 (2015).
- Whitford, C. M., Cruz-Morales, P., Keasling, J. D., Weber, T. The Design-Build-Test-Learn cycle for metabolic engineering of Streptomycetes. Essays in Biochemistry. , (2021).
