Este protocolo detalha um método aprimorado para sintetizar altos rendimentos de proteínas recombinantes a partir de um sistema de tradução de transcrição livre de células (TX-TL) livre de células .
Estreptomias spp. são uma das principais fontes de antibióticos clínicos e produtos químicos industriais. Estreptomyces venezuelae ATCC 10712 é uma cepa de rápido crescimento e um produtor natural de clororamfenicol, jadomicina e espikromicina, o que o torna um candidato atraente como um chassi de biologia sintética de última geração. Portanto, ferramentas genéticas que aceleram o desenvolvimento da S. venezuelae ATCC 10712, bem como outros modelos de Estreptomia spp. são altamente desejáveis para a engenharia e descoberta de produtos naturais. Para isso, um sistema dedicado de isento de células S. venezuelae ATCC 10712 é fornecido neste protocolo para permitir a expressão heteróloga de alto rendimento de genes G+C (%) elevados. Este protocolo é adequado para reações em lote de pequena escala (10-100 μL) em formato de placa de 96 ou 384 poços, enquanto as reações são potencialmente escaláveis. O sistema livre de células é robusto e pode alcançar altos rendimentos (~5-10 μ M) para uma gama de proteínas recombinantes em uma configuração mínima. Este trabalho também incorpora um amplo instrumento de plasmídeo para medição em tempo real de mRNA e síntese proteica, bem como a coloração de fluorescência em gel de proteínas marcadas. Este protocolo também pode ser integrado com fluxos de trabalho de caracterização de expressão genética de alto throughput ou o estudo de vias enzimóricas de genes G+C (%) altos presentes nos genomas de Actinomycetes.
Os sistemas de tradução de transcrição sem células (TX-TL) fornecem uma plataforma ideal de prototipagem para biologia sintética para implementar ciclos rápidos de projeto-construção-teste-aprender, a estrutura de engenharia conceitual para biologia sintética1. Além disso, há um crescente interesse em sistemas TX-TL para a produção de proteína recombinante de alto valor em um ambiente de reação aberta22, por exemplo, para incorporar aminoácidos não-padrão em conjugados de anticorpos 3. Especificamente, tX-TL requer um extrato celular, DNA plasmídeo ou linear, e uma solução energética para catalisar a síntese proteica em reações em lote ou semicontinuos. Enquanto o Escherichia coli TX-TL é o sistema dominante sem células, vários sistemas TX-TL não-modelo emergentes têm atraído atenção para diferentes aplicações4,5,6,7,8. As principais vantagens do TX-TL incluem escala flexível (nanoliter para escala de litro)9,10, reprodutibilidade forte e fluxos de trabalho automatizados8,11,12. Em particular, a automação do TX-TL permite a caracterização acelerada de partes genéticas e elementos regulatórios8,12,13.
Em termos de configuração de reação, o TX-TL requer fontes de energia primárias e secundárias, bem como aminoácidos, cofatores, aditivos e uma sequência de DNA de modelo. Os triptofatos nucleotídeos (NTPs) fornecem a principal fonte de energia para conduzir mRNA inicial (ATP, GTP, CTP e UTP) e síntese proteica (apenas ATP e GTP). Para aumentar os rendimentos de TX-TL, os NTPs são regenerados através do catabolismo de uma fonte de energia secundária, como maltose14, maltodextrina15, glicose14, 3-fosfogliceto (3-PGA)16, fosfoenolpyruvate17 e L-glutamate18. Esta atividade metabólica inerente é surpreendentemente versátil, mas mal estudada, especialmente em sistemas TX-TL emergentes. Cada fonte de energia tem propriedades e vantagens distintas em termos de rendimento ATP, estabilidade química e custo, o que é uma consideração importante para reações TX-TL dimensionadas. Até agora, os protocolos atuais para E. coli TX-TL atingiram até 4,0 mg/mL (~157 μM) para o modelo de proteína fluorescente verde (GFP), usando uma mistura de 3-PGA (30 mM), maltodextrina (60 mM) e costela D-ose (30 mM) como fonte de energia secundária19.
Recentemente, houve um crescente interesse em estudar vias biossintéticas metabólicas secundárias nos sistemas TX-TL20,21,22. Especificamente, a Actinobacteria é uma das principais fontes de metabólitos secundários, incluindo antibióticos e produtos químicos agrícolas23,24. Seus genomas são enriquecidos com os chamados aglomerados genéticos biossintéticos (BGCs), que codificam caminhos enzimáticos para a biossíntese metabólica secundária. Para o estudo de partes genéticas actinobactérias e vias biossintéticas, uma série de sistemas TX-TL baseados em Estreptomíces foram recentemente desenvolvidos5,6,25,26. Estes sistemas especializados de Estreptomia TX-TL são potencialmente benéficos pelas seguintes razões: [1] provisão de um ambiente de dobramento de proteína nativa para enzimas de Estreptomia spp.26; [2] acesso a um pool de tRNA ideal para alta expressão genética G+C (%) ; [3] metabolismo primário ativo, que potencialmente pode ser sequestrado para o fornecimento de precursores biossintéticos; e [4] provisão de enzimas, precursores ou cofatores do metabolismo secundário presentes no extrato celular nativo. Assim, um kit de ferramentas S.venezuelae TX-TL de alto rendimento foi recentemente estabelecido para aproveitar essas capacidades únicas5.
Streptomyces venezuelae é um emergente hospedeiro para biologia sintética com uma rica história em biotecnologia industrial5,27,28,29 e como um sistema modelo para estudar a divisão celular e regulação genética em Actinobacteria30,31,32. A cepa principal, S. venezuelae ATCC 10712, possui um genoma relativamente grande de 8,22 Mb com 72,5% de teor de G+C (%) (número de adesão: CP029197), que codifica 7377 sequências de codificação, 21 rRNAs, 67 tRNAs e 30 clusters genéticos biossintéticos27. Em biologia sintética, s. venezuelae ATCC 10712 é um chassi atraente para a expressão heteróloga de vias biossintéticas. Ao contrário da maioria das outras manchas de Estreptomia, ela fornece várias vantagens fundamentais, incluindo um tempo de duplicação rápida (~40 min), uma extensa gama de ferramentas genéticas e experimentais5,28, falta de agrupamento micelial e esporulação em mídia líquida28,33. Vários estudos também demonstraram o uso de S. venezuelae para produção heteróloga de uma variedade diversificada de metabólitos secundários, incluindo poliketídeos, peptídeos ribossômicos e nãoribosomais34,35,36,37,38. Essas características combinadas fazem dessa cepa um hospedeiro microbiano atraente para aplicações de biologia sintética e engenharia metabólica. Embora s. venezuelae não seja o modelo dominante de Estreptomia para expressão genética heteróloga, com desenvolvimentos adicionais, ele é preparado para uso mais amplo dentro da descoberta de produtos naturais.
Este manuscrito apresenta um protocolo detalhado (Figura 1) para um sistema S. venezuelae TX-TL de alto rendimento, que foi atualizado do protocolo original publicado anteriormente26. Neste trabalho, a solução energética e as condições de reação foram otimizadas para aumentar o rendimento da proteína até 260 μg/mL para a proteína repórter mScarlet-I em uma reação em lote de 4h, 10 μL, utilizando um plasmídeo padrão, pTU1-A-SP44-mScarlet-I. Este plasmídeo foi especificamente projetado para permitir vários métodos de detecção de expressão proteica. O protocolo também é simplificado, enquanto o sistema de energia foi otimizado para reduzir a complexidade e o custo de configurar reações livres de células sem comprometer o rendimento. Juntamente com o sistema TX-TL otimizado, uma biblioteca de partes genéticas foi desenvolvida para a expressão genética de ajuste fino e como ferramentas fluorescentes para monitorar tx-tl em tempo real, criando assim uma plataforma versátil para prototipagem de expressão genética e caminhos biossintéticos de produtos naturais de Estreptomyces spp. e Actinobacteria relacionada.
Neste trabalho, o plasmídeo padrão recomendado (pTU1-A-SP44-mScarlet-I) pode ser usado para estabelecer o fluxo de trabalho S. venezuelae TX-TL em um novo laboratório e está disponível no AddGene (ver Tabela Suplementar S1). pTU1-A-SP44-mScarlet-I oferece ao usuário a flexibilidade para estudar outros quadros de leitura aberta (ORFs). O ORF mScarlet-I é otimizado para a expressão genética S. venezuelae. O promotor SP44 é um forte promotor constitutivo que é altamente ativo tanto em E. coli quanto em Streptomyces spp.39. O plasmídeo tem dois locais de enzima de restrição única (NdeI, BamHI) para permitir a subs clonagem de novos ORFs no quadro com um sistema de etiqueta de aglutinante arsádico de coresceína (FlAsH) do terminal C. Alternativamente, ambas as tags podem ser removidas com a inclusão de um códon stop após a subs clonagem de um novo gene. Com este vetor base, a expressão de alto rendimento de uma gama de proteínas tem sido demonstrada, ou seja, proteínas da via de biossíntese de oxitetracíclina e um síntese de peptídeo não cansarático não característico (NRPS) de Estreptomíces rimosus (Figura 2). Em termos de detecção de mRNA, o plasmídeo padrão pTU1-A-SP44-mScarlet-I contém um aptamer dBroccoli (na região 3′-não traduzida) para detecção com a sonda 3,5-difluoro-4-hydroxibenzylidene imidazolinone (DFHBI). Para maior flexibilidade, um porta-ferramentas de peças MoClo compatíveis com EcoFlex40 também foi disponibilizado no AddGene, incluindo um vetor de visão de visor de estreptomíceos compatível com EcoFlex (pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP) e uma gama de plasmídeos de variante pTU1-A-SP44 expressando proteína de fluorescência verde superpatosa (sfGFP), mScarlet-I, mVenus-I e β-glucurdasonie (GUS). Em particular, o plasmídeo pSF1C-A é derivado do pAV-gapdh28 e é curado de locais BsaI/BsmBI para montagem moClo. pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP é equivalente ao pTU1-A-RFP/pTU2-A-RFP do EcoFlex40, mas contém funcionalidade adicional para conjugação e integração cromossômica em Estreptomíces spp. usando o sistema de integração phiC3128.
A primeira etapa do protocolo envolve o crescimento do S. venezuelae ATCC 10712 ou uma cepa intimamente relacionada, colheita celular em fase de médio exponencial, etapas de lavagem celular e equilíbrio em buffers S30A e S30B. Esta etapa requer três dias, e o tempo para o crescimento celular pode ser usado para preparar os componentes restantes conforme descrito abaixo. As células colhidas são então líficas por sônica, esclarecidas e submetidas a uma reação de escoado. Nesta fase final de preparação, os extratos celulares podem ser preparados para armazenamento a longo prazo a -80 °C para minimizar a perda de atividade. Para a montagem de reações TX-TL usando este protocolo, é apresentado um Streptomyces Master Mix (SMM), com a opção de um formato de Solução de Energia Mínima (MES) que dá rendimentos comparáveis. Além disso, recomenda-se a estria de uma nova cultura de S. venezuelae ATCC 10712 a partir de um estoque de glicerol de -80 °C em uma placa de ágar gym e incubar a 28 °C por pelo menos 48-72 h até que colônias únicas sejam visíveis. Apenas culturas frescas devem ser usadas para as seguintes etapas.
Neste manuscrito, um protocolo S. venezuelae TX-TL de alto rendimento foi descrito com etapas detalhadas que são simples de conduzir tanto para usuários experientes quanto para novos usuários de sistemas TX-TL. Vários recursos dos protocolos Streptomyces45 e E. coli TX-TL41 foram removidos para estabelecer um protocolo mínimo, mas de alto rendimento para o S. venezuelae TX-TL5,26.<…
The authors have nothing to disclose.
Os autores gostariam de reconhecer o seguinte suporte à pesquisa: EPSRC [EP/K038648/1] para SJM como PDRA com PSF; Wellcome Trust patrocinou bolsa issf para SJM com PSF no Imperial College London; Bolsa de pesquisa da Royal Society [RGS\R1\191186]; Prêmio Wellcome Trust SEED [217528/Z/19/Z] para SJM na Universidade de Kent; e Global Challenges Research Fund (GCRF) Bolsa de doutorado para KC na Universidade de Kent.
2.5 L UltraYield Flask | Thomson | 931136-B | |
3-PGA (>93%) | Sigma | P8877 | |
384 Well Black/Clear Bottom Plate | ThermoFisher | 10692202 | |
Ammonium chloride (98%) | Fluorochem | 44722 | |
ATP, CTP, UTP, GTP (100 mM solution, >99%) | ThermoFisher | R0481 | |
Carbenicillin (contact supplier for purity) | Melford | C46000-25.0 | |
D-(+)-glucose (contact supplier for purity) | Melford | G32040 | |
DFHBI (≥98% – HPLC) | Sigma | SML1627 | |
DTT (contact supplier for purity) | Melford | MB1015 | |
FlAsH-EDT2 (contact supplier for purity) | Santa Cruz Biotech | sc-363644 | |
Glucose-6-phosphate (>98%) | Sigma | G7879 | |
HEPES Free Acid (contact supplier for purity) | Melford | B2001 | |
L-glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate (>98%) | Sigma | 49605 | |
Magnesium chloride (98%) | Fluorochem | 494356 | |
Malt extract | Sigma | 70167-500G | |
PEG-6000 | Sigma | 807491 | |
Pierce 96-well Microdialysis Plate, 10K MWCO | ThermoFisher | 88260 | |
Poly(vinyl sulfate) potassium salt | Sigma | 271969 | |
Potassium glutamate (>99%) | Sigma | G1149 | |
RTS amino acid sampler | 5 Prime | 2401530 | |
Sodium chloride (99%) | Fluorochem | 94554 | |
Supelclean LC-18 SPE C-18 SPE column (1 g) | Sigma | 505471 | |
Yeast Extract | Melford | Y1333 | |
Equipment | |||
Platereader | BMG | Omega |