Un kit de herramientas de transcripción y traducción de Streptomyces de alto rendimiento para aplicaciones de biología sintética y productos naturales
Summary
Este protocolo detalla un método mejorado para sintetizar altos rendimientos de proteínas recombinantes a partir de un sistema de transcripción-traducción libre de células (TX-TL) de Streptomyces venezuelae .
Abstract
Streptomyces spp. son una fuente importante de antibióticos clínicos y productos químicos industriales. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 es una cepa de rápido crecimiento y un productor natural de cloranfenicol, jadomicina y pikromicina, lo que la convierte en un candidato atractivo como chasis de biología sintética de próxima generación. Por lo tanto, las herramientas genéticas que aceleran el desarrollo de S. venezuelae ATCC 10712, así como otros modelos de Streptomyces spp., son altamente deseables para la ingeniería y el descubrimiento de productos naturales. Con este fin, se proporciona un sistema dedicado S . venezuelae ATCC 10712 libre de células en este protocolo para permitir la expresión heteróloga de alto rendimiento de genes de alto G + C (%). Este protocolo es adecuado para reacciones por lotes a pequeña escala (10-100 μL) en formato de placa de 96 o 384 pocillos, mientras que las reacciones son potencialmente escalables. El sistema libre de células es robusto y puede lograr altos rendimientos (~ 5-10 μ M) para una gama de proteínas recombinantes en una configuración mínima. Este trabajo también incorpora un amplio conjunto de herramientas de plásmidos para la medición en tiempo real de la síntesis de ARNm y proteínas, así como la tinción de fluorescencia en gel de proteínas marcadas. Este protocolo también se puede integrar con flujos de trabajo de caracterización de expresión génica de alto rendimiento o el estudio de vías enzimáticas de genes de alto G + C (%) presentes en genomas de Actinomycetes.
Introduction
Los sistemas de transcripción-traducción sin células (TX-TL) proporcionan una plataforma de creación de prototipos ideal para la biología sintética para implementar ciclos rápidos de diseño-construcción-prueba-aprendizaje, el marco de ingeniería conceptual para la biología sintética1. Además, existe un creciente interés en los sistemas TX-TL para la producción de proteínas recombinantes de alto valor en un entorno de reacción abierta2, por ejemplo, para incorporar aminoácidos no estándar en conjugados anticuerpo-fármaco3. Específicamente, TX-TL requiere un extracto celular, plásmido o ADN lineal, y una solución energética para catalizar la síntesis de proteínas en reacciones por lotes o semicontinuas. Si bien Escherichia coli TX-TL es el sistema libre de células dominante, una serie de sistemas TX-TL no modelo emergentes han atraído la atención para diferentes aplicaciones4,5,6,7,8. Las ventajas clave de TX-TL incluyen escalabilidad flexible (escala de nanolitro a litro)9,10, una fuerte reproducibilidad y flujos de trabajo automatizados8,11,12. En particular, la automatización de TX-TL permite la caracterización acelerada de partes genéticas y elementos reguladores8,12,13.
En términos de configuración de reacción, TX-TL requiere fuentes de energía primarias y secundarias, así como aminoácidos, cofactores, aditivos y una secuencia de ADN plantilla. Los trifosfatos de nucleótidos (NTP) proporcionan la fuente de energía primaria para impulsar el ARNm inicial (ATP, GTP, CTP y UTP) y la síntesis de proteínas (solo ATP y GTP). Para aumentar los rendimientos de TX-TL, los NTP se regeneran a través del catabolismo de una fuente de energía secundaria, como maltosa14, maltodextrina15, glucosa14, 3-fosfoglicerato (3-PGA)16, fosfoenolpiruvato17 y L-glutamato18. Esta actividad metabólica inherente es sorprendentemente versátil, pero poco estudiada, especialmente en sistemas TX-TL emergentes. Cada fuente de energía tiene propiedades y ventajas distintas en términos de rendimiento de ATP, estabilidad química y costo, lo cual es una consideración importante para las reacciones TX-TL a escala. Hasta el momento, los protocolos actuales para E. coli TX-TL han alcanzado hasta 4,0 mg/mL (~157 μM) para el modelo de proteína verde fluorescente (GFP), utilizando una mezcla de 3-PGA (30 mM), maltodextrina (60 mM) y D-ribosa (30 mM) como fuente de energía secundaria19.
Recientemente, ha habido un creciente interés en el estudio de las vías biosintéticas de metabolitos secundarios en sistemas TX-TL20,21,22. Específicamente, las Actinobacterias son una fuente importante de metabolitos secundarios, incluyendo antibióticos y productos químicos agrícolas23,24. Sus genomas están enriquecidos con los llamados grupos de genes biosintéticos (BGC), que codifican vías enzimáticas para la biosíntesis de metabolitos secundarios. Para el estudio de las partes genéticas de Actinobacterias y las vías biosintéticas, recientemente se ha desarrollado una gama de sistemas TX-TL basados en Streptomyces5,6,25,26. Estos sistemas especializados Streptomyces TX-TL son potencialmente beneficiosos por las siguientes razones: [1] provisión de un entorno de plegamiento de proteínas nativas para enzimas de Streptomyces spp.26; [2] acceso a un grupo óptimo de ARNt para la alta expresión génica de G+C (%) [3] metabolismo primario activo, que potencialmente puede ser secuestrado para el suministro de precursores biosintéticos; y [4] suministro de enzimas, precursores o cofactores del metabolismo secundario presentes en el extracto de células nativas. Por lo tanto, recientemente se ha establecido un kit de herramientas S.venezuelae TX-TL de alto rendimiento para aprovechar estas capacidades únicas5.
Streptomyces venezuelae es un huésped emergente para la biología sintética con una rica historia en biotecnología industrial5,27,28,29 y como sistema modelo para el estudio de la división celular y la regulación genética en Actinobacteria30,31,32. La cepa tipo principal, S. venezuelae ATCC 10712, tiene un genoma relativamente grande de 8,22 Mb con un contenido de G+C del 72,5% (%) (número de acceso: CP029197), que codifica 7377 secuencias codificantes, 21 ARNr, 67 ARNt y 30 grupos de genes biosintéticos27. En biología sintética, S. venezuelae ATCC 10712 es un chasis atractivo para la expresión heteróloga de vías biosintéticas. A diferencia de la mayoría de las otras tinciones de Streptomyces, proporciona varias ventajas clave, incluyendo un rápido tiempo de duplicación (~40 min), una amplia gama de herramientas genéticas y experimentales5,28, falta de aglomeración micelial y esporulación en medios líquidos28,33. Varios estudios también han demostrado el uso de S. venezuelae para la producción heteróloga de una amplia gama de metabolitos secundarios, incluyendo policétidos, péptidos ribosómicos y no ribibosomales34,35,36,37,38. Estas características combinadas hacen de esta cepa un huésped microbiano atractivo para aplicaciones de biología sintética e ingeniería metabólica. Si bien S. venezuelae no es el modelo dominante de Streptomyces para la expresión génica heteróloga, con nuevos desarrollos, está preparado para un uso más amplio dentro del descubrimiento de productos naturales.
Este manuscrito presenta un protocolo detallado (Figura 1) para un sistema S. venezuelae TX-TL de alto rendimiento, que ha sido actualizado a partir del protocolo original publicado anteriormente26. En este trabajo, la solución energética y las condiciones de reacción se han optimizado para aumentar el rendimiento proteico hasta 260 μg/mL para la proteína reportera mScarlet-I en una reacción por lotes de 4 h, 10 μL, utilizando un plásmido estándar, pTU1-A-SP44-mScarlet-I. Este plásmido ha sido diseñado específicamente para permitir varios métodos de detección de la expresión de proteínas. El protocolo también se simplifica, mientras que el sistema de energía se ha optimizado para reducir la complejidad y el costo de configurar reacciones sin células sin comprometer el rendimiento. Junto con el sistema TX-TL optimizado, se ha desarrollado una biblioteca de partes genéticas para ajustar la expresión génica y como herramientas fluorescentes para monitorear TX-TL en tiempo real, creando así una plataforma versátil para la creación de prototipos de expresión génica y vías biosintéticas de productos naturales de Streptomyces spp. y Actinobacterias relacionadas.
En este trabajo, el plásmido estándar recomendado (pTU1-A-SP44-mScarlet-I) se puede utilizar para establecer el flujo de trabajo de S. venezuelae TX-TL en un nuevo laboratorio y está disponible en AddGene (ver Tabla suplementaria S1). pTU1-A-SP44-mScarlet-I proporciona al usuario la flexibilidad de estudiar otros marcos de lectura abierta (ORF). El ORF mScarlet-I está optimizado para la expresión génica de S. venezuelae. El promotor SP44 es un fuerte promotor constitutivo que es altamente activo tanto en E. coli como en Streptomyces spp.39. El plásmido tiene dos sitios únicos de enzimas de restricción (NdeI, BamHI) para permitir la subclonación de nuevos ORF en el marco con un sistema conjunto de etiqueta FLAG-terminal C y horquilla arsenical de fluoresceína (FlAsH). Alternativamente, ambas etiquetas se pueden eliminar con la inclusión de un codón de parada después de la subclonación de un nuevo gen. Con este vector base, se ha demostrado la expresión de alto rendimiento de una gama de proteínas, a saber, proteínas de la vía de biosíntesis de oxitetraciclina y una péptido sintetasa no ribossomal no caracterizada (NRPS) de Streptomyces rimosus (Figura 2). En términos de detección de ARNm, el plásmido estándar pTU1-A-SP44-mScarlet-I contiene un aptámero dBroccoli (en la región 3′-no traducida) para la detección con la sonda 3,5-difluoro-4-hidroxibencilideno imidazolinona (DFHBI). Para una mayor flexibilidad, también se ha puesto a disposición en AddGene un conjunto de herramientas de piezas MoClo compatibles con EcoFlex40, incluido un vector lanzadera Streptomyces compatible con EcoFlex (pSF1C-A-RFP /pSF2C-A-RFP) y una gama de plásmidos variantes de pTU1-A-SP44 que expresan proteína de fluorescencia verde supercarpeta (sfGFP), mScarlet-I, mVenus-I y β-glucuronidasa (GUS). En particular, el plásmido pSF1C-A se deriva de pAV-gapdh28 y se cura de los sitios BsaI / BsmBI para el ensamblaje de MoClo. pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP es equivalente a pTU1-A-RFP/pTU2-A-RFP de EcoFlex40, pero contiene funcionalidad adicional para la conjugación y la integración cromosómica en Streptomyces spp. utilizando el sistema de integrasa phiC3128.
La primera etapa del protocolo implica el crecimiento de la S. venezuelae ATCC 10712 o una cepa estrechamente relacionada, la cosecha celular en la fase exponencial media, los pasos de lavado celular y el equilibrio en los tampones S30A y S30B. Esta etapa requiere tres días, y el tiempo para el crecimiento celular se puede utilizar para preparar los componentes restantes como se describe a continuación. Las células cosechadas se lisan por sonicación, se clarifican y se someten a una reacción de escorrentía. En esta etapa final de preparación, los extractos celulares se pueden preparar para el almacenamiento a largo plazo a -80 ° C para minimizar la pérdida de actividad. Para el ensamblaje de reacciones TX-TL utilizando este protocolo, se presenta un Streptomyces Master Mix (SMM), con la opción de un formato de Solución de Energía Mínima (MES) que da rendimientos comparables. Además, se recomienda rayar un cultivo fresco de S. venezuelae ATCC 10712 a partir de un caldo de glicerol de -80 °C en un plato de agar GYM e incubar a 28 °C durante al menos 48-72 h hasta que se vean colonias individuales. Solo se deben usar cultivos frescos para los siguientes pasos.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este manuscrito, se ha descrito un protocolo S. venezuelae TX-TL de alto rendimiento con pasos detallados que son fáciles de llevar a cabo tanto para usuarios experimentados como nuevos de sistemas TX-TL. Se han eliminado varias características de los protocolos streptomyces45 y E. coli TX-TL41 existentes para establecer un protocolo mínimo, pero de alto rendimiento para S. venezuelae TX-TL5,26.<su…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean reconocer el siguiente apoyo a la investigación: EPSRC [EP/K038648/1] para SJM como PDRA con PSF; Wellcome Trust patrocinó la beca ISSF para SJM con PSF en el Imperial College de Londres; Beca de investigación de la Royal Society [RGS\R1\191186]; Premio Wellcome Trust SEED [217528/Z/19/Z] para SJM en la Universidad de Kent; y la beca de doctorado del Fondo de Investigación de Desafíos Globales (GCRF) para KC en la Universidad de Kent.
Materials
| 2.5 L UltraYield Flask | Thomson | 931136-B | |
| 3-PGA (>93%) | Sigma | P8877 | |
| 384 Well Black/Clear Bottom Plate | ThermoFisher | 10692202 | |
| Ammonium chloride (98%) | Fluorochem | 44722 | |
| ATP, CTP, UTP, GTP (100 mM solution, >99%) | ThermoFisher | R0481 | |
| Carbenicillin (contact supplier for purity) | Melford | C46000-25.0 | |
| D-(+)-glucose (contact supplier for purity) | Melford | G32040 | |
| DFHBI (≥98% – HPLC) | Sigma | SML1627 | |
| DTT (contact supplier for purity) | Melford | MB1015 | |
| FlAsH-EDT2 (contact supplier for purity) | Santa Cruz Biotech | sc-363644 | |
| Glucose-6-phosphate (>98%) | Sigma | G7879 | |
| HEPES Free Acid (contact supplier for purity) | Melford | B2001 | |
| L-glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate (>98%) | Sigma | 49605 | |
| Magnesium chloride (98%) | Fluorochem | 494356 | |
| Malt extract | Sigma | 70167-500G | |
| PEG-6000 | Sigma | 807491 | |
| Pierce 96-well Microdialysis Plate, 10K MWCO | ThermoFisher | 88260 | |
| Poly(vinyl sulfate) potassium salt | Sigma | 271969 | |
| Potassium glutamate (>99%) | Sigma | G1149 | |
| RTS amino acid sampler | 5 Prime | 2401530 | |
| Sodium chloride (99%) | Fluorochem | 94554 | |
| Supelclean LC-18 SPE C-18 SPE column (1 g) | Sigma | 505471 | |
| Yeast Extract | Melford | Y1333 | |
| Equipment | |||
| Platereader | BMG | Omega |
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