التصوير الالتصاق الجزيئي في الخلية المتداول بواسطة Adhesion بصمة المقايسة
Summary
يقدم هذا البروتوكول الإجراءات التجريبية لإجراء فحص بصمة الالتصاق لتصوير أحداث التصاق أثناء التصاق سريع بالخلايا.
Abstract
التصاق المتداول ، الذي تسهله التفاعلات بوساطة selectin ، هو حركة ديناميكية وسلبية للغاية في تجنيد الكريات البيض إلى موقع الالتهاب. تحدث هذه الظاهرة في عدد الخلايا الجنوية بعد الشعيرات الدموية ، حيث يدفع تدفق الدم الكريات البيض في حركة متجددة على الخلايا البطانية. يتطلب المتداول المستقر توازنا دقيقا بين تكوين رابطة التصاق وانفصالها المدفوع ميكانيكيا ، مما يسمح للخلية بالبقاء ملتصقة بالسطح أثناء الدوران في اتجاه التدفق. وخلافا لعمليات الالتصاق الأخرى التي تحدث في بيئات ثابتة نسبيا، الالتصاق المتداول ديناميكية للغاية كما الخلايا المتداول السفر عبر الآلاف من ميكرون في عشرات ميكرون في الثانية الواحدة. وبالتالي، فإن أساليب علم الأحياء الميكانيكية التقليدية مثل المجهر قوة الجر غير مناسبة لقياس أحداث الالتصاق الفردية والقوى الجزيئية المرتبطة بها بسبب النطاق الزمني القصير والحساسية العالية المطلوبة. هنا، ونحن نصف لدينا أحدث تنفيذ قياس بصمة الالتصاق لتصوير P-selectin: PSGL-1 التفاعلات في التصاق المتداول على المستوى الجزيئي. تستخدم هذه الطريقة الحبال مقياس التوتر المستندة إلى الحمض النووي لا رجعة فيه لإنتاج تاريخ دائم من أحداث الالتصاق الجزيئي في شكل مسارات مضان. يمكن تصوير هذه المسارات بطريقتين: (1) خياطة الآلاف من الصور المحدودة الحيود لإنتاج مجال رؤية كبير ، مما يتيح استخراج بصمة التصاق لكل خلية متجددة على آلاف الميكرونات في الطول ، (2) أداء DNA-PAINT لإعادة بناء صور فائقة الدقة للمسارات الفلورية داخل مجال صغير من الرؤية. في هذه الدراسة، تم استخدام فحص بصمة الالتصاق لدراسة خلايا HL-60 المتداول في ضغوط القص المختلفة. وبذلك، تمكنا من تصوير التوزيع المكاني ل P-selectin: تفاعل PSGL-1 واكتساب نظرة ثاقبة على قواهم الجزيئية من خلال كثافة الفلورسينس. وهكذا، توفر هذه الطريقة الأساس للتحقيق الكمي لمختلف التفاعلات بين الخلايا والسطح المشاركة في التصاق المتداول على المستوى الجزيئي.
Introduction
تصف سلسلة التصاق المتداول كيف ترتبط الخلايا المتداولة بحائط الأوعية الدموية ولفه على طوله1. يتم التوسط في المقام الأول المتداول السلبي من قبل selectins ، وهي فئة رئيسية من جزيئات الالتصاق الخلوي (CAMs)1. تحت تدفق القص من الدم، الكريات البيض التعبير عن P-selectin جليكبروتين ليغند-1 (PSGL-1) تشكل روابط عابرة للغاية مع P-selectin، والتي يمكن التعبير عنها على سطح الخلايا البطانية الملتهبة. هذه العملية حاسمة بالنسبة للخلايا البيض للهجرة إلى موقع الالتهاب2. وبالإضافة إلى ذلك، سان جيرمان-1 هو أيضا مستقبلات حساسة ميكانيكية قادرة على تحريك مرحلة الالتصاق الشركة اللاحقة من سلسلة التصاق المتداول عند مشاركتها مع P-selectin3.
الطفرات الوراثية التي تؤثر على وظيفة CAM يمكن أن تؤثر بشدة على الجهاز المناعي، كما هو الحال في المرض النادر لنقص التصاق الكريات البيض (LAD)، حيث يؤدي خلل جزيئات الالتصاق التي تتوسط المتداول إلى الأفراد الذين يعانون من نقص المناعة الشديد4،5،6. بالإضافة إلى ذلك ، ثبت أن الخلايا السرطانية المتداولة تهاجر بعد عملية المتداول مماثلة ، مما يؤدي إلى الانبثاث7،8. ومع ذلك ، لأن المتداول الخلية سريعة وديناميكية ، والأساليب التجريبية التقليدية الميكانيكية غير مناسبة لدراسة التفاعلات الجزيئية أثناء المتداول الخلية. في حين أن أساليب التلاعب أحادية الخلية وجزيء واحد مثل المجهر القوة الذرية وملاقط البصرية كانت قادرة على دراسة التفاعلات الجزيئية مثل التفاعل P-selectin تعتمد على القوة مع PSGL-1 على مستوى جزيء واحد9، فهي غير مناسبة للتحقيق في أحداث الالتصاق الحية أثناء المتداول الخلية. بالإضافة إلى ذلك ، لا يمكن للتفاعل المميز في المختبر الإجابة مباشرة على السؤال حول الالتصاق الجزيئي في الجسم الحي. على سبيل المثال، ما هو نطاق التوتر الجزيئي ذي الصلة بيولوجيا عندما تعمل الخلايا في بيئتها الأصلية؟ وقد استولت الأساليب الحاسوبية مثل محاكاة ديناميات لاصقة10 أو بسيطة ثابتة الحالة11 بعض التفاصيل الجزيئية وكيف تؤثر على السلوك المتداول ولكن تعتمد اعتمادا كبيرا على دقة المعلمات والافتراضات النمذجة. ويمكن لتقنيات أخرى مثل الفحص المجهري لقوة الجر الكشف عن القوى أثناء هجرة الخلايا ولكنها لا توفر دقة مكانية كافية أو معلومات كمية عن التوتر الجزيئي. لا يمكن لأي من هذه التقنيات أن توفر ملاحظات تجريبية مباشرة للديناميكيات الزمنية والتوزيع المكاني وعدم التجانس في القوى الجزيئية ، والتي ترتبط مباشرة بوظيفة الخلية وسلوكها في بيئتها الأصلية.
لذلك ، فإن تنفيذ مستشعر القوة الجزيئية القادر على قياس التفاعلات بوساطة selectin بدقة أمر بالغ الأهمية لتحسين فهمنا للالتصاق المتداول. هنا، ونحن نصف بروتوكول لacesay12 بصمة الالتصاق حيث يتم تدحرجت الخرز المغلفة PSGL-1 على سطح تقديم ف selectin الحبال قياس التوتر الوظيفية (TGTs)13. هذه TGTs هي أجهزة استشعار قوة تعتمد على الحمض النووي لا رجعة فيها والتي تؤدي إلى تاريخ دائم من أحداث التمزق في شكل قراءات مضان. ويتحقق ذلك من خلال تمزق TGT (dsDNA) ومن ثم وضع العلامات اللاحقة لTGT الممزق (ssDNA) مع حبلا تكميلية وصفت الفلورسنت. إحدى المزايا الرئيسية لهذا النظام هي توافقه مع كل من التصوير محدود الحيود والتصوير فائق الدقة. يمكن ربط الخيط التكميلي المسمى بالفلورسنت إما بشكل دائم (>12 نقطة أساس) للتصوير المحدود الحيود أو ملزم بشكل عابر (7-9 bp) للتصوير فائق الدقة من خلال DNA PAINT. هذا هو نظام مثالي لدراسة التصاق المتداول كما تمزق TGTs أثناء المتداول النشط، ولكن يتم تحليل قراءات مضان بعد المتداول. كما توفر طريقتان للتصوير للمستخدم المزيد من الحرية للتحقيق في التصاق المتداول. عادة، التصوير محدود الحيود مفيد لاستخراج قوة التمزق الجزيئي من خلال كثافة الفلورسينس13، في حين أن التصوير فائق الدقة يسمح بالتحليل الكمي لكثافة المستقبلات. مع القدرة على التحقيق في هذه الخصائص من التصاق المتداول، وهذا النهج يوفر منصة واعدة لفهم آلية تنظيم القوة على الالتصاق الجزيئي للخلايا المتداول تحت تدفق القص.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتيح فحص بصمة الالتصاق تصور أحداث التصاق الجزيئي بين PSGL-1 و P-selectin أثناء التصاق التدحرج الخلوي. يتم بدء هذه العملية عن طريق التقاط P-selectin بوساطة تليها المتداول تحت إجهاد القص السائل. عادة ما تنطوي المشكلات المحتملة أثناء التجربة على مسارات فلورية ضعيفة أو مفقودة حتى عندما تتدحرج الخلايا بشك…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل المؤسسة الكندية للابتكار (CFI 35492)، ومجلس العلوم الطبيعية والبحوث الهندسية في كندا منحة ديسكفري (RGPIN-2017-04407)، وصندوق الحدود الجديدة في البحوث (NFRFE-2018-00969)، ومؤسسة مايكل سميث للبحوث الصحية (SCH-2020-0559)، وصندوق جامعة كولومبيا البريطانية.
Materials
| 4-channel drill guide | Custom made | 3D printed with ABS filament | |
| 4-holes slide | Custom made | Drill clean microscope slide using a Dremel with diamond coated drill bits on a 4-channels drill guide which has a layout that matches with the centers of the 8-32 threaded holes on the aluminum clamp. | |
| Acetone | VWR | BDH1101-4LP | |
| Acrylic spacer | Custom made | Cut two blocks of acrylic sheets with the dimension of 40 mm x 30 mm x 2.5 mm. On each block, drill two 3 mm holes that are precisely aligned with the 4-40 holes on the aluminium holder. | |
| Aluminium chip holder | Custom made | Machine anodized aluminium block into a C-shaped holder with the outer dimension of 640 mm x 500 mm x 65 mm and the opening dimension of 400 mm x 380 mm x 65 mm. Inlets and outlets are tapped with 8-32 thread. | |
| Aminosilane | AlfaAesar | L14043 | CAS 1760-24-3 |
| Antibiotic/antimycotic solution | Cytiva HyClone | SV3007901 | Pen/Strep/Fungiezone |
| Beads, ProtG coated polystyrene | Spherotech | PGP-60-5 | |
| Bovine serum albumin | VWR | 332 | |
| Buffer, DNA PAINT | 0.05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA | ||
| Buffer, T50M5 | 10mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 | ||
| Buffer, Rolling | HBSS with 2mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0.1% BSA | ||
| Buffer, Wash | 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 and 2 mM CaCl2, 0.05% Tween 20 | ||
| Calcium chloride | VWR | BDH9224 | |
| Cell culture flasks | VWR | 10062-868 | |
| Concentrated sulfuric acid | VWR | BDH3072-2.5LG | 95-98% |
| Coverslip holding tweezers | Techni-Tool | 758TW150 | |
| Diamond-coated drill bits | Abrasive technology | C5250510 | 0.75 mm diamond drill |
| DNA, amine-ssDNA (top strand) | IDT DNA | Custom oligo | CCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/ |
| DNA, biotin-ssDNA (bottom strand) | IDT DNA | Custom oligo | /5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG |
| DNA, imager strand for DNA-PAINT | IDT DNA | Custom oligo | GAGGGAAA TT/3Cy3Sp/ |
| DNA, imager strand for permanent labelling | IDT DNA | Custom oligo | CCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/ |
| Double-sided tape | Scotch | 237 | 3/4 inch width, permanent double-sided tape |
| EDTA | Thermofisher | 15575020 | 0.5 M EDTA, pH 8.0 |
| Epoxy | Gorilla | 42001 | 5 minute curing time |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Avantor | 97068-085 | |
| GelGreen | Biotium | 41005 | |
| Glacial acetic acid | VWR | BDH3094-2.5LG | |
| Glass, Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| Glass, Microscope slide | VWR | 48300-026 | 75 mm x 25 mm x 1 mm |
| Glass, Staining jar | VWR | 74830-150 | Wheaton Staining Jar (900620) |
| Hanks' Balanced Salt solution (HBSS) | Lonza | 04-315Q | |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629-1EA | |
| HL-60 cells | ATCC | CCL-240 | |
| Humidity chamber slide support | Custom made | 3D printed with ABS filament | |
| Hydrogen peroxide | VWR | BDH7690-1 | 30% |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Inlets/outlets | Custom made | Drill through eight 8-32 set screws using cobalt drill bits. Insert 1.5 cm polyethylene tubing (Tygon, I.D. 1/32” O.D. 3/32”) into each hollow setscrew | |
| Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM) | Lonza | 12-722F | |
| Magnesium chloride | VWR | BDH9244 | |
| Magnetic Ni-NTA beads | Invitrogen | 10103D | |
| Mailer tubes | EMS | EMS71406-10 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Micro Bio-Spin P-6 Gel Columns | Biorad | 7326200 | In SSC Buffer |
| PEG | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000 | |
| PEG-biotin | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| Potassium hydroxide | VWR | 470302-132 | |
| Protein, Protein G | Abcam | ab155724 | N-terminal His-Tag and C-terminal cysteine |
| Protein, P-selectin-Fc | R&D System | 137-PS | Recombinant Human P-Selectin/CD62P Fc Chimera Protein, CF |
| Protein, Streptavidin | Cedarlane | CL1005-01-5MG | |
| Pump Syringe | Harvard Apparatus | 704801 | |
| Sodium bicarbonate | Ward’s Science | 470302-444 | |
| Sodium chloride | VWR | 97061-274 | |
| Sulfo-SMCC | Thermofisher | 22322 | |
| Syringe | Hamilton | 81520 | Syringes with PTFE luer lock, 5 mL |
| Syringe needles | BD | 305115 | Precision Glide 26 G, 5/8 Inch Length |
| TCEP | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Tris | VWR | BDH4502-500GP | |
| Tubing, Adaptor | Tygon | ABW00001 | Formulation 3350, I.D. 1/32”; O.D. 3/32” |
| Tubing, Polyethylene | BD Intramedic | 427406 | Intramedic (PE20) I.D. 0.38mm; O.D. 1.09mm |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 93773 |
Riferimenti
- McEver, R. P., Zhu, C. Rolling cell adhesion. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 363-396 (2010).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: The leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- Zarbock, A., Ley, K. Neutrophil adhesion and activation under flow. Microcirculation. 16 (1), 31-42 (2009).
- Etzioni, A. Adhesion molecules – Their role in health and disease. Pediatric Research. 39 (2), 191-198 (1996).
- van de Vijver, E., vanden Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Leukocyte adhesion deficiencies. Hematology/Oncology Clinics of North America. 27 (1), 101-116 (2013).
- Hanna, S., Etzioni, A. Leukocyte adhesion deficiencies. Annals of the New York Academy of Sciences. 1250 (1), 50-55 (2012).
- Geng, Y., Marshall, J. R., King, M. R. Glycomechanics of the metastatic cascade: Tumor cell-endothelial cell interactions in the circulation. Annals of Biomedical Engineering. 40 (4), 790-805 (2012).
- Yasmin-Karim, S., King, M. R., Messing, E. M., Lee, Y. F. E-selectin ligand-1 controls circulating prostate cancer cell rolling/adhesion and metastasis. Oncotarget. 5 (23), 12097-12110 (2014).
- Marshall, B. T., Long, M., Piper, J. W., Yago, T., McEver, R. P., Zhu, C. Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules. Nature. 423 (6936), 190-193 (2003).
- Hammer, D. A. Adhesive dynamics. Journal of Biomechanical Engineering. 136 (2), 021006 (2014).
- Yasunaga, A. B., Murad, Y., Kapras, V., Menard, F., Li, I. T. S. Quantitative interpretation of cell rolling velocity distribution. Biophysical Journal. 120 (12), 2511-2520 (2021).
- Li, I. T. S., Ha, T., Chemla, Y. R. Mapping cell surface adhesion by rotation tracking and adhesion footprinting. Scientific Reports. 7 (1), 44502 (2017).
- Yasunaga, A. B., Li, I. T. S. Quantification of fast molecular adhesion by fluorescence footprinting. Science Advances. 7 (34), (2021).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1040 (2011).
- Zhu, M., Lerum, M. Z., Chen, W. How to prepare reproducible, homogeneous, and hydrolytically stable aminosilane-derived layers on silica. Langmuir. 28 (1), 416-423 (2012).
- Chandradoss, S. D., Haagsma, A. C., Lee, Y. K., Hwang, J. H., Nam, J. M., Joo, C. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).
- Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. Super-resolution microscopy with DNA-PAINT. Nature Protocols. 12 (6), 1198-1228 (2017).
- Chalfoun, J., et al. MIST: Accurate and scalable microscopy image stitching tool with stage modeling and error minimization. Scientific Reports. 7 (1), 4988 (2017).
- Wang, X., et al. Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors. Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).
- Crockett-Torabi, E. Selectins and mechanisms of signal transduction. Journal of Leukocyte Biology. 63 (1), 1-14 (1998).
- Ye, Z., et al. The P-selectin and PSGL-1 axis accelerates atherosclerosis via activation of dendritic cells by the TLR4 signaling pathway. Cell Death and Disease. 10 (7), 507 (2019).
- Saha, K., Bender, F., Gizeli, E. Comparative study of IgG binding to proteins G and A: Nonequilibrium kinetic and binding constant determination with the acoustic waveguide device. Analytical Chemistry. 75 (4), 835-842 (2003).
- Murad, Y., Li, I. T. S. Quantifying molecular forces with serially connected force sensors. Biophysical Journal. 116 (7), 1282-1291 (2019).
- Yasunaga, A. B., Murad, Y., Li, I. T. S. Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors. Physical Biology. 17 (1), 011001 (2020).
