Questo protocollo dimostra come utilizzare l'ospite della pianta per rilevare le proteine salivari delle cicaline e le proteine virali vegetali rilasciate dai vettori delle cicaline.
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Articolo metodologico
Rilevamento del virus e delle proteine salivari di un vettore cicalina nell'ospite della pianta
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli insetti vettori trasmettono orizzontalmente molti virus vegetali di importanza agricola. Più della metà dei virus vegetali sono trasmessi da insetti emitteri che hanno apparato boccale penetrante-succhiatore. Durante la trasmissione virale, la saliva dell'insetto collega il virus-vettore-ospite perché i virus vettori della saliva e le proteine degli insetti innescano o sopprimono la risposta immunitaria delle piante dagli insetti agli ospiti delle piante. L'identificazione e l'analisi funzionale delle proteine salivari stanno diventando una nuova area di interesse nel campo di ricerca delle interazioni arbovirus-ospite. Questo protocollo fornisce un sistema per rilevare le proteine nella saliva delle cicaline utilizzando l'ospite della pianta. Il vettore cicalina Nephotettix cincticeps infettato dal virus nano del riso (RDV) serve come esempio. La vitellogenina e la principale proteina del capside esterno P8 di RDV veicolata dalla saliva di N. cincticeps possono essere rilevate simultaneamente nella pianta di riso di cui si nutre N. cincticeps. Questo metodo è applicabile per testare le proteine salivari che vengono trattenute transitoriamente nell'ospite della pianta dopo l'alimentazione degli insetti. Si ritiene che questo sistema di rilevamento andrà a beneficio dello studio delle interazioni emittero-virus-pianta o emittero-pianta.
Introduzione
La modalità di trasmissione vettore-ospite degli arbovirus, un problema fondamentale, è alla frontiera della scienza biologica. Molti virus vegetali di importanza agricola sono trasmessi orizzontalmente da insetti vettori1. Più della metà dei virus vegetali sono veicolati da insetti emitteri, tra cui afidi, mosche bianche, cicaline, cicaline e tripidi. Questi insetti hanno caratteristiche distinte che consentono loro di trasmettere in modo efficiente i virus delle piante1. Possiedono apparato boccale penetrante-succhiante e si nutrono della linfa di floema e xilema e secernono la loro saliva 1,2,3....
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Protocollo
Le cicaline adulte non virulifere sono state propagate nel Vector-borne Virus Research Center della Fujian Agriculture and Forestry University, in Cina.
1. Allevamento di insetti non viruliferi
- Allevare gli adulti su piantine di riso in una gabbia cubica di 40 cm x 35 cm x 20 cm (lunghezza x larghezza x altezza). Tenere un lato della gabbia coperto con una rete a prova di insetti per la ventilazione.
- Tenere le gabbie con cicaline in un'incubatrice che contenga un regolatore di umidità integrato a 26 °C con un'umidità relativa del 60-75% in un fotoperiodo di 16 ore di luce e 8 ore di buio.
- Usa un aspira....
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Risultati
La figura 1 illustra tutte le fasi di questo protocollo: allevamento di insetti, acquisizione del virus, raccolta di proteine salivari attraverso l'alimentazione del riso e western blot. I risultati delle macchie occidentali hanno mostrato che bande specifiche e attese di circa 220 kDa sono state osservate nei campioni di riso e ghiandole salivari di insetti sulla membrana incubata con anticorpi contro Vg. Al contrario, nessuna banda è stata osservata nel campione di riso non alimen.......
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Discussione
La saliva direttamente secreta dalle ghiandole salivari degli insetti penetranti svolge un ruolo fondamentale perché predigerisce e disintossica i tessuti ospiti e i fattori biologici cross-kingdom dei vettori negli ospiti 1,3,4. I fattori biologici cross-kingdom, inclusi elicitori, effettori e piccolo RNA, sono critici per la comunicazione insetto-ospite14,15,16
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (31772124 e 31972239) e della Fujian Agriculture and Forestry University (Grant KSYLX014).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagenti | |||
| Tris base | Roche | D609K69032 | Per 5&volte; Tampone tris-glicina e 10× Preparazione tampone TBS |
| glicina | Sigma-Aldrich | WXBD0677V | Per 5&volte; Preparazione del tampone tris-glicina |
| SDS | Sigma-Aldrich | SLCB4394 | Per 5&volte; Preparazione del tampone tris-glicina |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | per 10&volte; Preparazione del tampone TBS |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016318 | per 10&volte; Preparazione del tampone TBS |
| ß-mercaptoetanolo | Reagente Xiya | B14492 | Per 4&volte; preparazione del tampone del campione proteico |
| blu di bromofenolo | Sigma-Aldrich | SHBL3668 | Per 4&volte; preparazione del tampone del campione proteico |
| glicerolo | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | Per la preparazione del tampone del campione proteico 4&volte; |
| metanolo | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10014118 | Per la preparazione del tampone di trasferimento |
| Tween 20 | Coolaber SCIENCE& TeCHNoLoGY | CT30111220 | Per la preparazione TBST |
| latte secco scremato | Becton.Dickinso and company | 252038 | Per il blocco della membrana, la diluizione degli anticorpi |
| capra anti-coniglio IgG | Sangon Biotech | D110058-0001 | Riconoscimento del |
| kit ECL Western | ThermoFisher Scientific | 32209 | Substrato chemiluminescente |
| nitrocellulosa membrana | Pall Corporation | 25312915 | Per il trasferimento di proteine |
| Tamponi e soluzioni | |||
| Buffer | Composizione | Comments/Description | |
| 5&volte; Tampone tris-glicina | 15,1 g Tris base 94 g glicina 5 g di SDS in 1 L di acqua | Soluzione stock | |
| 1&volte; Tampone tris-glicina | 200 mL da 5× Tampone tris-glicina 800 mL di acqua | Soluzione di lavoro, per SDS-PAGE | |
| 10&volte; Soluzione salina tamponata Tris (TBS) tampone | 80 g NaCl 30 g Tris base 2 g KCl in 1 L di acqua | madre | |
| TBS con soluzione Tween 20 (TBST) | 100 mL 10× Soluzione TBS 3 mL Tween 20 900 mL di acqua | Soluzione di lavoro | |
| 4& tampone campione proteico | 8 g SDS 4 mL ß-mercaptoetanolo 0,02 g di blu di bromofenolo 40 mL di glicerolo in 40 mL 0,1 M Tris-HCl (pH 6,8) | Per l'estrazione di proteine | |
| Tampone di trasferimento | 800 mL di tampone tris-glicina 200 mL di metanolo | Per trasferimento di proteine | |
| Instruments | |||
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | SHBL3668 | Per la preparazione di tamponi per campioni di proteine |
| 4x Incubatore a temperatura costante | Ningbo Saifu Experimental Instrument Co., Ltd. | PRX-1200B | Per l'allevamento di cicaline |
| Elettroforesi | Tanon Science & Fornitore verificato - Technology Co., Ltd. | Tanon EP300 | Per SDS-PAGE |
| Modulo centrale di trasferimento elettroforetico | BIO-RAD | 1703935 | Per SDS-PAGE |
| glicerolo | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | Per 4x preparazione di tamponi per campioni di proteine |
| glicina Sigma-Aldrich | WXBD0677V | Per 5x preparazione di tamponi tris-glicina | |
| capra anti-coniglio IgG | Sangon Biotech | D110058-0001 | Riconoscimento dello strumento primario e |
| passa-alto per la macinazione dei tessuti | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd. | JXFSIPRP-24 | Per la macinazione di tessuti vegetali |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016318 | Per la preparazione di tamponi 10x TBS |
| metanolo | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10014118 | Per la preparazione del tampone di trasferimento |
| Mini canale di trasferimento di calore umido | BIO-RAD | 1703930 | Per SDS-PAGE |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | Per la preparazione del tampone 10x TBS |
| membrana nitrocellulosica | Pall Corporation | 25312915 | Per il trasferimento di proteine |
| latte secco scremato | Becton.Dickinso e società | 252038 | Per il blocco della membrana, la diluizione degli anticorpi |
| Pierce ECL Western kit | ThermoFisher Scientific | 32209 | Substrato chemiluminescente |
| Strumento per il colore delle proteine | GE Sanità bio-scienze AB | Amersham lmager 600 | Per la rilevazione |
| di proteine SDS | Sigma-Aldrich | SLCB4394 | Per 5x preparazione di tampone Tris-glicina |
| Tris base | Roche | D609K69032 | Per 5x tampone Tris-glicina e 10× Preparazione del tampone TBS |
| Tween 20 | Coolaber SCIENCE& TeCHNoLoGY | CT30111220 | Per la preparazione TBST |
| Vasca per elettroforesi a piastra verticale | BIO-RAD | 1658001 | SDS-PAGE |
| Shanghai Jinghong Experimental equipment Co., Ltd. | XMTD-8222 | Per far bollire i campioni proteici | |
| β-mercaptoetanolo | Reagente Xiya | B14492 | Per la preparazione di tamponi per campioni proteici 4x |
Riferimenti
- Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
- Cranston, P. S., Gullan, P. J. Phylogeny of insects. Encyclopedia of Insects. Resh, V. H., Carde, R. T. , Academic. Amste....
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Ristampe e permessi
