Il toolkit genomico funzionale per i nematodi parassiti Strongyloides stercoralis e Strongyloides ratti comprende transgenesi, mutagenesi mediata da CRISPR/Cas9 e RNAi. Questo protocollo dimostrerà come utilizzare la microiniezione intragonennale per introdurre transgeni e componenti CRISPR in S. stercoralis e S. ratti.
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Articolo metodologico
Generazione di transgenici e knockout in specie di Strongyloides mediante microiniezione
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il genere Strongyloides è costituito da più specie di nematodi penetranti nella pelle con diverse gamme di ospiti, tra cui Strongyloides stercoralis e Strongyloides ratti. S. stercoralis è un nematode umano-parassitario, penetrante nella pelle che infetta circa 610 milioni di persone, mentre il parassita del ratto S. ratti è strettamente correlato a S. stercoralis ed è spesso usato come modello di laboratorio per S. stercoralis. Sia S. stercoralis che S. ratti sono facilmente suscettibili alla generazione di transgenici e knockout attraverso la tecnica di somministrazione esogena di acido nucleico della microiniezione intragonadiale e, come tali, sono emersi come sistemi modello per altri elminti parassiti che non sono ancora suscettibili a questa tecnica.
Gli adulti parassiti di Strongyloides abitano l'intestino tenue del loro ospite e rilasciano la progenie nell'ambiente attraverso le feci. Una volta nell'ambiente, le larve si sviluppano in adulti che vivono liberi, che vivono nelle feci e producono progenie che deve trovare e invadere un nuovo ospite. Questa generazione ambientale è unica per la specie Strongyloides e abbastanza simile nella morfologia al modello di nematode a vita libera Caenorhabditis elegans che le tecniche sviluppate per C. elegans possono essere adattate per l'uso con questi nematodi parassiti, compresa la microiniezione intragonadiale. Utilizzando la microiniezione intragonadiale, un'ampia varietà di transgeni può essere introdotta in Strongyloides. I componenti CRISPR/Cas9 possono anche essere microiniettati per creare larve mutanti di Strongyloides . Qui, viene descritta la tecnica di microiniezione intragonennale in Strongyloides, compresa la preparazione di adulti liberi, la procedura di iniezione e la selezione della progenie transgenica. Sono incluse immagini di larve transgeniche di Strongyloides create utilizzando la mutagenesi CRISPR/Cas9. Lo scopo di questo documento è quello di consentire ad altri ricercatori di utilizzare la microiniezione per creare Strongyloides transgenici e mutanti.
Introduzione
Strongyloides stercoralis è stato a lungo trascurato come un importante agente patogeno umano rispetto agli anchilostomi più ampiamente riconosciuti e al nematode Ascaris lumbricoides1. Precedenti studi sul carico di vermi spesso hanno gravemente sottovalutato la prevalenza di S. stercoralis a causa della bassa sensibilità dei metodi diagnostici comuni per S. stercoralis2. Negli ultimi anni, studi epidemiologici basati su strumenti diagnostici migliorati hanno stimato che la vera prevalenza delle infezioni da S. stercoralis è molto più alta di quanto precedentemente r....
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Protocollo
NOTA: I gerbilli erano usati per passare S. stercoralis, e i ratti erano usati per passare S. ratti. Tutte le procedure sono state approvate dall'UCLA Office of Animal Research Oversight (Protocollo n. 2011-060-21A), che aderisce agli standard AAALAC e alla Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Le seguenti attività devono essere completate almeno un giorno prima della microiniezione: coltura di vermi, preparazione di microiniezione, creazione di costrutti per il mix di microiniezione e diffusione di batteri (E. coli HB101) su piastre di 6 cm Nematode Growth Media (NGM)8. Le femmine che vivono libere ....
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Risultati
Se l'esperimento ha avuto successo, le larve F1 esprimeranno il fenotipo transgenico e/o mutante di interesse (Figura 4). Tuttavia, i tassi di trasformazione sono molto variabili e dipendono dai costrutti, dalla salute dei vermi, dalle condizioni di coltura post-iniezione e dall'abilità dello sperimentatore. In generale, un esperimento di successo produrrà >15 F1 larve per femmina iniettata e un tasso di trasformazione di >3% per i marcatori fluorescenti. Se il nu.......
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Discussione
Questo protocollo di microiniezione descrive in dettaglio i metodi per introdurre costrutti per la transgenesi e la mutagenesi mediata da CRISPR / Cas9 in S. stercoralis e S. ratti. Sia per S. stercoralis che per S. ratti, la sopravvivenza post-iniezione e il tasso di transgenesi o mutagenesi sono soggetti a diverse variabili che possono essere messe a punto.
La prima considerazione critica per una transgenesi di successo è come sono costruiti i transgeni p.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Ringraziamenti
pPV540 e pPV402 sono stati regali gentili del Dr. James Lok dell'Università della Pennsylvania. Ringraziamo Astra Bryant per i commenti utili sul manoscritto. Questo lavoro è stato finanziato da un Burroughs-Wellcome Fund Investigators in the Pathogenesis of Disease Award, un Howard Hughes Medical Institute Faculty Scholar Award e National Institutes of Health R01 DC017959 (E.A.H.).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| (&meno;)-Nicotina, ≥ 99% (GC), nicotina liquida | Sigma-Aldrich | N3876-5ML | per paralizzare i vermi Morsetto |
| a C in ferro da 3", 3" x 2" (capacità x profondità) | VWR | 470121-790 | per fissare l'installazione al banco Agarosio |
| LE Agarosio Phenix | RBA-500 | per vetrini | |
| Carbone osseo, secchio da 4 libbre, carbone Ebonex n/a da 10 x 28 mesh | per colture | ||
| di carbone fecaleCarbone osseo, granuli, 10 x 28 mesh | Reade | bonechar10x28 | carbone per colture fecali (alternativo al precedente) |
| Micromanipolatore grossolano | Narishige | MMN-1 | Micromanipolatore grossolano |
| Corning Costar Filtri per provette da centrifuga Corning Costar Spin-X | 07-200-385 | Colonna per microfiltri | |
| Vetro di copertura, 48 x 60 mm, spessore n. 1 | Brain Research Lab | 4860-1 | vetrini coprioggetti (48 x 60 mm) |
| Piastre di Petri profonde, versione pesante con 6 prese d'aria, diametro 100 mm | VWR | 82050-918 | Piastre di Petri da 10 cm (per colture di carbone fecale) |
| Base per storta Eisco con asta | Fisher | 12-000-101 | supporto per apparecchio Baermann |
| Punte per microiniettore Eppendorf FemtoJet | VWR | 89009-310 | per il riempimento di aghi per microiniezione |
| Sottocuscinetti assorbenti Fisherbrand | Fisher | 14-206-62 | Carta da banco (per preparazione) |
| Anelli in ghisa Fisherbrand | Fisher | 14-050CQ | O-ring Baermann Bicchieri |
| polipropilene a tre angoli Fisherbrand | Fisher | 14-955-111F | Bicchiere in plastica (per miscelazione) |
| Bicchieri in polipropilene a tre angoli Fisherbrand | Fisher | 14-955-111F | Bicchiere in plastica (per secchio di raccolta/secchio d'acqua) |
| Fisherbrand becher in polipropilene a tre angoli | Fisher | 14-955-111F | Bicchiere in plastica (x2) (per realizzare il supporto) |
| Gorilla epoxie in siringa | Colla McMaster-Carr | 7541A51 | (per fissare i tubi) |
| Olio alocarbonico 700 | Sigma-Aldrich | H8898-50ML | alocarbonico |
| Tubi in gomma siliconica per alte temperature per alimenti e bevande, 1/2" ID, 5/8" OD | McMaster-Carr | 3038K24 | tubo (per imbuto) |
| Imbuti KIMAX, gambo lungo, 60° Angolo, Kimble Chase | VWR | 89001-414 | Imbuto Baermann |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science protezioni da banco | Fisher | 15-235-101 | carta da banco (per la preparazione) |
| Stereomicroscopio Leica con fluorescenza | Stereomicroscopio Leica | M165 FC | GFP per l'identificazione e lo smistamento di vermi transgenici |
| microINJECTOR porta-aghi a braccio dritto in ottone | Tritech | Sistema | porta ago per microiniezione |
| Tritech | microiniezione | MINJ-1 | |
| Gerbilli mongoli | Charles River Laboratories | 213-Gerbilli mongoli per il | mantenimento di S. stercoralis, maschio 4-6 settimane |
| Sacchetti Nasco Whirl-Pak facili da chiudere, 18 oz | VWR | 11216-776 | Sacchetti per campioni Whirl-Pak |
| Tulle di nylon (rete) | Jo-Ann Fabrics | zprd_14061949a | rete di nylon per supporto Baermann |
| Filo di platino, 36 gauge, per pollice | Thomas Scientific | 1233S72 | filo di platino/iridio per plettri a vite Abbassalingua |
| puritani, 152 mm (L) x 17,5 mm (L) | VWR | 62505-007 | (per miscelare campioni) |
| Kit miniprep QIAprep Spin (250)Kit miniprep | |||
| QIAGEN 27106 QIAGENRatti-Long Evans | Envigo | 140 HsdBlu:LE Ratti Long Evans | per il mantenimento di S. ratti, femmina 4-6 settimane |
| Ratti-Sprague Dawley | Envigo | 002 Hsd:Sprague Dawley SD | ratti per il mantenimento di S. ratti, femmina 4-6 settimane |
| Scatole davvero utili scatole di stoccaggio traslucide con coperchi, capacità 1,6 L, 7-5/8" x 5-5/16" x 4-5/16" | Office Depot | 452369 | scatole di plastica per camera |
| umidificataScheda tecnica Shepherd, 8 x 16,5 pollici | Newco | 999589 techboard | |
| Pavimento in filo metallico rialzato in acciaio inossidabile | Fondi per gabbie metalliche | Ancare | R20SSRWF |
| Cucchiai per posate compostabili StalkMarket, 6", bianco, confezione da 1.000 | cucchiai per 9587303 Office Depot | Piatto | |
| stender, tipo impilabile, 37 x 25 mm | Carolina (Science) | 741012 | occhiali per orologi (piccoli, rotondi) |
| Stereomicroscopio | Motic | K-400 LED | cannocchiale di preparazione per dissezione |
| , contenitore di stoccaggio, colore chiaro/bianco, altezza esterna 4-7/8 pollici, lunghezza esterna 13-5/8 pollici, Sterilite | Grainger | 53GN16 | scatole di plastica per camera umidificata |
| Estrattore per micropipette Sutter P-30 Estrattore | Sutter | P-30/P | con filamento di platino/iridio |
| Occhiali per orologi Syracuse | Fisher | S34826 | Occhiali da orologio (grandi, rotondi) |
| Thermo Scientific Castaloy morsetti ad angolo fisso | Fisher | 05-769-2Q | morsetti a imbuto (2x) |
| Micromanipolatore idrolico a olio con joystick sospeso a tre assi | Narishige | MM0-4 | micromanipolatore fine |
| United Mohr morsetti a pizzico Fisher | S99422 | Morsetti a pizzico (2x) | |
| Piastre di Petri ventilate e affilate (diametro 60 mm) | Tritech Research | T3308P | Piastre di Petri da 6 cm (per colture di carbone fecale su piccola scala) |
| Tergicristalli per tessuti leggeri VWR | VWR | 82003-820 | rivestimento per vetro dell'orologio con supporto Baermann |
| , quadrato, 1-5/8 in | Carolina (Science) | 742300 | occhiali per orologi (piccoli, quadrati) |
| Cerchi lisci di qualità Whatman, grado 1, diametro 5,5 cm | Fisher | 09-805B | carta da filtro (per Petri da 6 cm |
| Cerchi lisci di grado qualitativo Whatman, grado 1, | Fisher | 09-805D | (per piastre Petri da 10 cm) |
| Capillare in vetro borosilicato World Precision Instrument, capillari in vetro | Fisher | 50-821-813 | per aghi per microiniezione |
| Coltelli X-Acto, coltello n. 1 con deposito da ufficio n. 11 lame | 238816 | coltelli X-Acto senza lame per contenere i plettri | |
| Zeiss AxioObserver A1 | Zeiss | n/a | microscopio invertito |
Riferimenti
- Krolewiecki, A. J., et al. A public health response against Strongyloides stercoralis: time to look at soil-transmitted helminthiasis in full. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (5), 2165(2013).
- Buonfrate, D., et al.
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Ristampe e permessi
