Generere transgener og knockouts i Strongyloides arter ved mikroinjeksjon

Summary

Det funksjonelle genomiske verktøysettet for de parasittiske nematodene Strongyloides stercoralis og Strongyloides ratti inkluderer transgenese, CRISPR/Cas9-mediert mutagenese og RNAi. Denne protokollen vil demonstrere hvordan man bruker intragonadal mikroinjeksjon for å introdusere transgenes og CRISPR-komponenter i S. stercoralis og S. ratti.

Abstract

Slekten Strongyloides består av flere arter av hudgjennomtrengende nematoder med forskjellige vertsområder, inkludert Strongyloides stercoralis og Strongyloides ratti. S. stercoralis er en menneske-parasittisk, hudgjennomtrengende nematode som infiserer ca 610 millioner mennesker, mens rotteparasitten S. ratti er nært beslektet med S. stercoralis og brukes ofte som laboratoriemodell for S. stercoralis. Både S. stercoralis og S. ratti er lett mottagelige for genereringen av transgener og knockouts gjennom den eksogene nukleinsyreleveringsteknikken for intragonadal mikroinjeksjon, og som sådan har dukket opp som modellsystemer for andre parasittiske helminter som ennå ikke er mottagelige for denne teknikken.

Parasittiske Strongyloides voksne bor i tynntarmen til verten og frigjør avkom i miljøet via avføringen. En gang i miljøet utvikler larvene seg til frittlevende voksne, som lever i avføring og produserer avkom som må finne og invadere en ny vert. Denne miljøgenerasjonen er unik for Strongyloides-artene og ligner nok i morfologi til modellen frittlevende nematode Caenorhabditis elegans som teknikker utviklet for C. elegans kan tilpasses for bruk med disse parasittiske nematodene, inkludert intragonadal mikroinjeksjon. Ved hjelp av intragonadal mikroinjeksjon kan et bredt utvalg av transgenes innføres i Strongyloides. CRISPR/Cas9-komponenter kan også mikroinjiseres for å skape mutante Strongyloides larver. Her beskrives teknikken for intragonadal mikroinjeksjon i Strongyloides, inkludert fremstilling av frittlevende voksne, injeksjonsprosedyren og valg av transgen avkom. Bilder av transgene Strongyloides larver laget ved hjelp av CRISPR / Cas9 mutagenesis er inkludert. Målet med denne artikkelen er å gjøre det mulig for andre forskere å bruke mikroinjeksjon for å skape transgene og mutante Strongyloides.

Introduction

Strongyloides stercoralis har lenge blitt oversett som et viktig menneskelig patogen sammenlignet med de mer anerkjente krokormene og rundorm Ascaris lumbricoides¹. Tidligere studier av ormbyrde undervurderte ofte utbredelsen av S. stercoralis på grunn av den lave følsomheten til vanlige diagnostiske metoder for S. stercoralis². De siste årene har epidemiologiske studier basert på forbedrede diagnostiske verktøy anslått at den sanne forekomsten av S. stercoralis-infeksjoner er mye høyere enn tidligere rapportert, omtrent 610 millioner mennesker over hele verden².

Både S. stercoralis og andre Strongyloides-arter, inkludert den nært beslektede rotteparasitten og den vanlige laboratoriemodellen S. ratti, har en uvanlig livssyklus som er fordelaktig for eksperimentelle genomiske studier fordi den består av både parasittiske og frittlevende (miljømessige) generasjoner³ (figur 1). Spesielt kan både S. stercoralis og S. ratti sykle gjennom en enkelt frittlevende generasjon. Den frittlevende generasjonen består av post-parasittiske larver som utvikler seg til frittlevende voksne menn og kvinner; alle avkom av de frittlevende voksne utvikler seg til smittende larver, som må infisere en vert for å fortsette livssyklusen. Videre kan denne miljømessige eller frittlevende generasjonen eksperimentelt manipuleres i laboratoriet. Fordi frittlevende Strongyloides voksne og C. elegans voksne deler lignende morfologi, kan teknikker som intragonadal mikroinjeksjon som opprinnelig ble utviklet for C. elegans tilpasses for bruk med frittlevende voksen Strongyloides ^4,5. Mens DNA generelt introduseres til frittlevende voksne kvinner, kan både menn og kvinner av Strongyloides mikroinjiseres⁶. Dermed er funksjonelle genomiske verktøy tilgjengelige for å forhøre mange aspekter av Strongyloides biologi. Andre parasittiske nematoder mangler en frittlevende generasjon, og som et resultat er det ikke så lett egnet til funksjonelle genomiske teknikker³.

Figur 1: Strongyloides stercoralis livssyklus. S. stercoralis parasittiske kvinner bor i tynntarmen til sine pattedyrverter (mennesker, ikke-menneskelige primater, hunder). De parasittiske hunnene reproduserer ved parthenogenese og legger egg i tynntarmen. Eggene klekkes mens de fortsatt er inne i verten i postparasittiske larver, som deretter overføres inn i miljøet med avføring. Hvis de postparasittiske larver er mannlige, utvikler de seg til frittlevende voksne menn. Hvis de postparasittiske larver er kvinnelige, kan de enten utvikle seg til frittlevende voksne kvinner (indirekte utvikling) eller tredjetrinns infektive larver (iL3s; direkte utvikling). De frittlevende hannene og hunnene reproduserer seksuelt for å skape avkom som er begrenset til å bli iL3s. Under visse forhold kan S. stercoralis også gjennomgå autoinfeksjon, der noen av de postparasittiske larver forblir inne i vertstarmen i stedet for å passere inn i miljøet i avføring. Disse larvene kan utvikle seg til autoinfektive larver (L3a) inne i verten, trenge gjennom tarmveggen, migrere gjennom kroppen og til slutt gå tilbake til tarmen for å bli reproduktive voksne. Livssyklusen til S. ratti er lik, bortsett fra at S. ratti infiserer rotter og ikke har en autoinfective syklus. Miljøgenerasjonen er nøkkelen til å bruke Strongyloides arter til genetiske studier. De frittlevende voksne hunnene (P₀) kan mikroinjiseres; deres avkom, som alle vil bli iL3s, er potensielle F₁ transgenics. Denne figuren er endret fra Castelletto et al. ³. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

S. stercoralis deler mange aspekter av sin biologi med andre gastrointestinale menneske-parasittiske nematoder, inkludert vertsinvasjon og vertsimmunmodulering. For eksempel smitter human-parasittiske krokorm i slekten Necator og Ancylostoma også ved hudpenetrasjon, navigerer på samme måte gjennom kroppen, og til slutt bor som parasittiske voksne i tynntarmen⁷. Dermed bruker mange gastrointestinale nematoder sannsynligvis vanlig sensorisk oppførsel og immununndragelsesteknikker. Som et resultat vil kunnskapen fra Strongyloides utfylle funn i andre mindre genetisk gjennomførbare nematoder og føre til en mer fullstendig forståelse av disse komplekse og viktige parasittene.

Denne mikroinjeksjonsprotokollen skisserer metoden for å introdusere DNA i Strongyloides frittlevende voksne kvinner for å lage transgene og mutante avkom. Belastningsvedlikeholdskravene, inkludert utviklingstid for voksne ormer for mikroinjeksjoner og innsamling av transgent avkom, er beskrevet. Protokoller og en demonstrasjon av den komplette mikroinjeksjonsteknikken, sammen med protokoller for dyrking og screening av transgent avkom, er inkludert, sammen med en liste over alt nødvendig utstyr og forbruksvarer.

Protocol

MERK: Gerbils ble brukt til å passere S. stercoralis, og rotter ble brukt til å passere S. ratti. Alle prosedyrer ble godkjent av UCLA Office of Animal Research Oversight (Protokoll nr. 2011-060-21A), som overholder AAALAC-standarder og guide for pleie og bruk av laboratoriedyr. Følgende oppgaver må fullføres minst en dag før mikroinjektivering: ormkulturering, klargjøring av mikroinjeksjonsputer, opprette konstruksjoner for mikroinjeksjonsblandingen og spre bakterier (E. coli HB101) på…

Representative Results

Hvis eksperimentet var vellykket, vil F1 larver uttrykke transgene og / eller mutant fenotype av interesse (figur 4). Transformasjonsratene er imidlertid svært variable og avhenger av konstruksjonene, ormenes helse, etterinjeksjonskulturerende forhold og eksperimentets dyktighet. Generelt vil et vellykket eksperiment gi > 15 F1 larver per injisert kvinne og en transformasjonshastighet på >3% for fluorescerende markører. Hvis det totale antall levende avkom er i gjenn…

Discussion

Denne mikroinjeksjonsprotokollen beskriver metodene for innføring av konstruksjoner for transgenese og CRISPR/Cas9-mediert mutagenese i S. stercoralis og S. ratti. For både S. stercoralis og S. ratti er overlevelse etter injeksjon og graden av transgenese eller mutagenese underlagt flere variabler som kan finjusteres.

Det første kritiske hensynet for vellykket transgenese er hvordan plasmidtransgenes er konstruert. Tidligere studier har funnet at uttrykk…

Materials

(−)-Nicotine, ≥99% (GC), liquid	Sigma-Aldrich	N3876-5ML	nicotine for paralyzing worms
3" iron C-clamp, 3" x 2" (capacity x depth)	VWR	470121-790	C-clamp to secure setup to bench top
Agarose LE	Phenix	RBA-500	agarose for slides
Bone char, 4 lb pail, 10 x 28 mesh	Ebonex	n/a	charcoal for fecal-charcoal cultures
Bone char, granules, 10 x 28 mesh	Reade	bonechar10x28	charcoal for fecal-cultures (alternative to the above)
Coarse micromanipulator	Narishige	MMN-1	coarse micromanipulator
Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters	Fisher	07-200-385	microfilter column
Cover glass, 48 x 60 mm, No. 1 thickness	Brain Research Lab	4860-1	coverslips (48 x 60 mm)
Deep Petri dishes, heavy version with 6 vents, 100 mm diameter	VWR	82050-918	10 cm Petri dishes (for fecal-charcoal cultures)
Eisco retort base w/ rod	Fisher	12-000-101	stand for Baermann apparatus
Eppendorf FemtoJet microinjector microloader tips	VWR	89009-310	for filling microinjection needles
Fisherbrand absorbent underpads	Fisher	14-206-62	bench paper (for prepping)
Fisherbrand Cast-Iron Rings	Fisher	14-050CQ	Baermann o-ring
Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers	Fisher	14-955-111F	Plastic beaker (for mixing)
Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers	Fisher	14-955-111F	Plastic beaker (for catch bucket/water bucket)
Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers	Fisher	14-955-111F	Plastic beaker (x2) (to make holder)
Gorilla epoxie in syringe	McMaster-Carr	7541A51	glue (to attach tubing)
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898-50ML	halocarbon oil
High-temperature silicone rubber tubing for food and beverage, 1/2" ID, 5/8" OD	McMaster-Carr	3038K24	tubing (for funnel)
KIMAX funnels, long stem, 60° Angle, Kimble Chase	VWR	89001-414	Baermann funnel
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science benchtop protectors	Fisher	15-235-101	bench paper (for prepping)
Leica stereomicroscope with fluorescence	Leica	M165 FC	GFP stereomicroscope for identifying and sorting transgenic worms
microINJECTOR brass straight arm needle-holder	Tritech	MINJ-4	microinjection needle holder
microINJECTOR system	Tritech	MINJ-1	microinjection system
Mongolian Gerbils	Charles River Laboratories	213-Mongolian Gerbil	gerbils for maintenance of S. stercoralis, male 4-6 weeks
Nasco Whirl-Pak easy-to-close bags, 18 oz	VWR	11216-776	Whirl-Pak sample bags
Nylon tulle (mesh)	Jo-Ann Fabrics	zprd_14061949a	nylon mesh for Baermann holder
Platinum wire, 36 Gauge, per inch	Thomas Scientific	1233S72	platinum/iridium wire for worm picks
Puritan tongue depressors, 152 mm (L) x 17.5 mm (W)	VWR	62505-007	wood sticks (for mixing samples)
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)	QIAGEN	27106	QIAGEN miniprep kit
Rats-Long Evans	Envigo	140 HsdBlu:LE Long Evans	rats for maintenance of S. ratti, female 4-6 weeks
Rats-Sprague Dawley	Envigo	002 Hsd:Sprague Dawley SD	rats for maintenance of S. ratti, female 4-6 weeks
Really Useful Boxes translucent storage boxes with lids, 1.6 L capacity, 7-5/8" x 5-5/16" x 4-5/16"	Office Depot	452369	plastic boxes for humidified chamber
Shepherd techboard, 8 x 16.5 inches	Newco	999589	techboard
Stainless steel raised wire floor	Ancare	R20SSRWF	wire cage bottoms
StalkMarket compostable cutlery spoons, 6", white, pack of 1,000	Office Depot	9587303	spoons
Stender dish, stacking type, 37 x 25 mm	Carolina (Science)	741012	watch glasses (small, round)
Stereomicroscope	Motic	K-400 LED	dissecting prep scope
Storage tote, color clear/white, outside height 4-7/8 in, outside length 13-5/8 in, Sterilite	Grainger	53GN16	plastic boxes for humidified chamber
Sutter P-30 micropipette puller	Sutter	P-30/P	needle puller with platinum/iridium filament
Syracuse watch glasses	Fisher	S34826	watch glasses (large, round)
Thermo Scientific Castaloy fixed-angle clamps	Fisher	05-769-2Q	funnel clamps (2x)
Three-axis hanging joystick oil hydrolic micromanipulator	Narishige	MM0-4	fine micromanipulator
United Mohr pinchcock clamps	Fisher	S99422	Pinch clamps (2x)
Vented, sharp-edge Petri dishes (60 mm diameter)	Tritech Research	T3308P	6 cm Petri dishes (for small-scale fecal-charcoal cultures)
VWR light-duty tissue wipers	VWR	82003-820	lining for Baermann holder
watch glass, square, 1-5/8 in	Carolina (Science)	742300	watch glasses (small, square)
Whatman qualitative grade plain circles, grade 1, 5.5 cm diameter	Fisher	09-805B	filter paper (for 6 cm Petri dishes)
Whatman qualitative grade plain circles, grade 1, 9 cm diameter	Fisher	09-805D	filter paper (for 10 cm Petri dishes)
World Precision Instrument borosilicate glass capillary, 1.2 mm x 4 in	Fisher	50-821-813	glass capillaries for microinjection needles
X-Acto Knives, No. 1 Knife With No. 11 Blade	Office Depot	238816	X-Acto knives without blades to hold worm picks
Zeiss AxioObserver A1	Zeiss	n/a	inverted microscope