Radiosíntesis de 1-(2-[18F]Fluoroetilo)-L-Triptófano usando un protocolo de una olla y dos pasos

Summary

Aquí, describimos la radiosíntesis de 1-(2-[^18F]Fluoroethyl)-L-triptófano, un agente de imágenes por emisión de positrones para estudiar el metabolismo del triptófano, utilizando una estrategia de una olla y dos pasos en un sistema de síntesis de radioquímica con buenos rendimientos radioquímicos, alto exceso enantiomérico y alta confiabilidad.

Abstract

La vía de la quinurenina (KP) es una ruta primaria para el metabolismo del triptófano. La evidencia sugiere fuertemente que los metabolitos del KP desempeñan un papel vital en la proliferación de tumores, la epilepsia, las enfermedades neurodegenerativas y las enfermedades psiquiátricas debido a sus efectos inmunomoduladores, neuromoduladores y neurotóxicos. El agente de tomografía por emisión de positrones (PET) más utilizado para mapear el metabolismo del triptófano, α-[^11C]metil-L-triptófano ([^11C]AMT), tiene una vida media corta de 20 min con laboriosos procedimientos de radiosíntesis. Se requiere un ciclotrón in situ para radiosintetizar [^11C]AMT. Solo un número limitado de centros produce [^11C]AMT para estudios preclínicos e investigaciones clínicas. Por lo tanto, se necesita urgentemente el desarrollo de un agente de imagen alternativo que tenga una vida media más larga, una cinética in vivo favorable y que sea fácil de automatizar. La utilidad y el valor de 1-(2-[^18F]fluoroetilo)-L-triptófano, un análogo de triptófano marcado con flúor-18, se ha reportado en aplicaciones preclínicas en xenoinjertos derivados de líneas celulares, xenoinjertos derivados de pacientes y modelos de tumores transgénicos.

Este artículo presenta un protocolo para la radiosíntesis de 1-(2-[^18F]fluoroetilo)-L-triptófano utilizando una estrategia de una olla y dos pasos. Utilizando este protocolo, el radiotrazador se puede producir en un rendimiento radioquímico del 20 ± 5% (desintegración corregida al final de la síntesis, n > 20), con pureza radioquímica y exceso enantiomérico de más del 95%. El protocolo presenta una pequeña cantidad de precursor con no más de 0,5 ml de disolvente de reacción en cada paso, baja carga de 4,7,13,16,21,24-hexaoxa-1,10-diazabiciclo[8.8.8]hexacosano potencialmente tóxico (K222) y una fase móvil ambientalmente benigna e inyectable para la purificación. El protocolo se puede configurar fácilmente para producir 1-(2-[^18F]fluoroetilo)-L-triptófano para la investigación clínica en un módulo disponible comercialmente.

Introduction

En los seres humanos, el triptófano es un componente esencial de la dieta diaria. El triptófano se metaboliza principalmente a través de la vía de la quinurenina (KP). El KP es catalizado por dos enzimas limitantes de velocidad, indolamina 2, 3-dioxigenasa (IDO) y triptófano 2, 3-dioxigenasa (TDO). Más del 95% del triptófano se convierte en quinurenina y sus metabolitos aguas abajo, generando en última instancia nicotinamida adenina dinucleótido, que es esencial para la transducción de energía celular. El KP es un regulador clave del sistema inmune y un importante regulador de la neuroplasticidad y los efectos neurotóxicos1,2. El metabolismo anormal del triptófano está implicado en varios trastornos neurológicos, oncológicos, psiquiátricos y metabólicos; por lo tanto, los análogos de triptófano radiomarcados se han utilizado ampliamente en la investigación clínica. Los dos radiotrazadores de triptófano más comúnmente investigados clínicamente son 11C-α-metil-L-triptófano ([^11C]AMT) y ^{11C-5-hidroxitriptófano} (^11C-5-HTP)3.

En la década de 1990, se utilizó 11C-5-HTP para visualizar tumores neuroendocrinos secretores de ^serotonina4 y para diagnosticar y monitorizar la terapia del adenocarcinoma prostático metastásico refractario a las ^hormonas5. Posteriormente, se utilizó como herramienta de imagen para la cuantificación del sistema serotoninérgico en el páncreas ^endocrino6. ¹¹ C-5-HTP también ha sido un trazador prometedor para la detección no invasiva de islotes viables en el trasplante intraportal de islotes y diabetes tipo ^27,8. En las últimas dos décadas, muchos aminoácidos radiomarcados han avanzado a la investigación ^clínica9,10. En particular, el análogo de triptófano marcado con ^{carbono-11 [11C}]AMT ha recibido una amplia atención por mapear la síntesis de serotonina cerebral11,12,13,14 y por localizar focos epilépticos, tumores epileptogénicos, complejo de esclerosis tuberosa, gliomas y cánceres de mama15,16,17,18,19,20 ^,21,22,23,24,25,26. [^11C] La AMT también tiene una alta captación en varios tumores de bajo y alto grado en ^niños27. Además, se ha utilizado el análisis de trazadores cinéticos de [^11C]AMT en sujetos humanos para diferenciar y clasificar diversos tumores y diferenciar el glioma de la lesión tisular inducida por ^radiación15. [^11C] Las imágenes guiadas por AMT muestran beneficios clínicos significativos en los trastornos ^{cerebrales3,25}. Sin embargo, debido a la corta vida media del carbono-11 (20 min) y los laboriosos procedimientos de radiosíntesis, el uso de [^11C]AMT está restringido a los pocos centros de PET con un ciclotrón en el sitio y una instalación de radioquímica.

El flúor-18 tiene una vida media favorable de 109,8 min, en comparación con la vida media de 20 min del carbono-11. Cada vez más, los esfuerzos se han centrado en el desarrollo de radiotrazadores marcados con flúor-18 para el metabolismo del triptófano3,28. Se han reportado un total de 15 radiotrazadores de triptófano radiomarcados con flúor-18 únicos en términos de radiomarcado, mecanismos de transporte, estabilidad in vitro e in vivo, biodistribución y captación de tumores en xenoinjertos. Sin embargo, se observó una rápida defluoración in vivo para varios trazadores, incluidos el fluorotriptófano 4, 5 y 6-[^18F], lo que impidió una mayor traducción ^clínica29. 5-[^18F]Fluoro-α-metiltriptófano (5-[^18F]FAMT) y 1-(2-[^18F]fluoroetilo)-L-triptófano (L-[^18F]FETrp, también conocido como (S)-2-amino-3-(1-(2-[^18F]fluoroetilo)-1H-indol-3-il)ácido propanoico, peso molecular 249,28 g/mol), son los dos radiotrazadores más prometedores con cinética in vivo favorable en modelos animales y gran potencial para superar [¹¹¹ C]AMT para la evaluación de condiciones clínicas con metabolismo de triptófano ^{desregulado28}. 5-[^18F]FAMT mostró una alta captación en xenoinjertos tumorales IDO1 positivos de ratones inmunocomprometidos y es más específico para obtener imágenes del KP que [^11C]AMT28,30. Sin embargo, la estabilidad in vivo de 5-[^18F]FAMT sigue siendo una preocupación potencial ya que no se han reportado datos de defluoración in vivo más allá de los 30 minutos posteriores a la inyección del trazador30.

Un estudio preclínico en un modelo de ratón con meduloblastoma modificado genéticamente mostró que, en comparación con la 18F-fluorodesoxiglucosa (^18F-FDG), L-[^18F]FETrp tenía una alta acumulación en tumores cerebrales, una defluoración in vivo insignificante y una baja absorción de fondo, lo que demuestra una relación superior entre objetivos y no ^{objetivos31,32}. Los estudios de dosimetría de radiación en ratones indicaron que L-[^18F]FETrp tenía una exposición a dosimetría favorable aproximadamente un 20% menor que el trazador clínico de PET 18F-FDG33. De acuerdo con los hallazgos de otros investigadores, los datos de los estudios preclínicos proporcionan evidencia sustancial para apoyar la traducción clínica de L-[^18F]FETrp para la investigación del metabolismo anormal del triptófano en humanos con trastornos cerebrales como epilepsia, neurooncología, autismo y esclerosis tuberosa28,31,32,33,34,35,36 . En la Tabla 1 se muestra una comparación general entre los tres trazadores más ampliamente investigados para el metabolismo del triptófano, 11C-5-HTP, [^11C]AMT y L-[^18F]FETrp. Tanto 11C-5-HTP como [^11C]AMT tienen una vida media corta y procedimientos de radioetiquetado laboriosos. Aquí se describe un protocolo para la radiosíntesis de L-[^18F]FETrp utilizando un enfoque de un solo pot y dos pasos. El protocolo incluye el uso de una pequeña cantidad de precursor de radiomarcado, un pequeño volumen de disolventes de reacción, baja carga de K222 tóxico y una fase móvil ambientalmente benigna e inyectable para la purificación y la fácil formulación.

Protocol

PRECAUCIÓN: El protocolo involucra materiales radiactivos. Cualquier dosis adicional de materiales radiactivos podría conducir a un aumento proporcional en la probabilidad de efectos adversos para la salud como el cáncer. Los investigadores deben seguir las prácticas de dosis “tan bajas como sea razonablemente posible” (ALARA) para guiar el protocolo de radiosíntesis con la protección adecuada en la celda caliente o la campana de plomo. Minimizar el tiempo de contacto directo, usar un escudo de plomo y mantener la …

Representative Results

El esquema de reacción se muestra en la Figura 1. El radioetiquetado incluye los dos pasos siguientes: 1) reacción del precursor de radiomarcado de tosilato con [18F]fluoruro proporciona el intermedio marcado con 18F, y 2) la desprotección de los grupos tert-butiloxicarbonilo y terc-butilo-protector en el intermedio proporciona el producto final L-[18F]FETrp. Ambos pasos de reacción continúan a 100 °C durante 10 min. <p class="jove…

Discussion

El triptófano es un aminoácido esencial para los seres humanos. Juega un papel importante en la regulación del estado de ánimo, la función cognitiva y el comportamiento. Los derivados del triptófano radiomarcados, en particular el [11C]AMT marcado con ^carbono-11, han sido ampliamente estudiados debido a su papel único en el mapeo de la síntesis de ^{serotonina38,39}, la detección y clasificación de ^tumores40, la guía de …

Materials

[18F]Fluoride in [18O]H2O	PETNET Solutions Inc.	N/A
4,7,13,16,21,24-hexaoxa-1,10-diazabicyclo[8.8.8]hexacosane	ACROS	291950010	Kryptofix 222 or K222, 98%
Acetic acid	ACROS	222142500	99.8%
Acetonitrile	Sigma-Aldrich	271004	anhydrous, 99.8%
Agilent 1260 HPLC system	Agilent Technologies	Agilent 1260	Agilent 1260 series
Analytcial chiral HPLC column	Sigma-Aldrich	12024AST	Astec CHIROBIOTIC T, 25 cm × 4.6 mm
Carbon dioxide, 60 LBS	Airgas	REFR744R200S	99.99%
D-FETrp standard reference	Affinity Research Chemicals Inc	N/A	Custom synthesis
Empty sterile vial	Jubilant HollisterStier	7515	20 mm closure, 10 mL
Ethanol	Decon Labs	2716	200 proof, USP grade. ≥99.9%
Fisherbrand 13 mm Syringe Filter, 0.22 µm, PVDF, sterile	Fisher Scientific	09-720-3
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	30721	≥37%
Isopropanol	Decon Labs	8316	70%, sterile
L-[18F]FETrp radiolabeling precursor	Affinity Research Chemicals Inc	N/A	Custom synthesis
L-FETrp standard reference	Affinity Research Chemicals Inc	N/A	Custom synthesis
Light C8 cartridge	Waters	WAT036770	Sep-Pak  C8 plus light cartridge
Needle, 20 G x 1	Becton-Dickinson & Co.	305175
Needle, 20 G x 1 ½	Becton-Dickinson & Co.	305176
Needle, 21 G x 2	Becton-Dickinson & Co.	305129
Neutral aluminum oxide	Waters	WAT023561	Sep-Pak alumina N plus light
Nylon membrane (0.20 µm )	MilliPore	GNWP04700	47 mm
Pall Acrodisc 25 mm syringe sterile filter	Pall Corporation	4907
PETCHEM radiochemistry synthesis system	PETCHEM Solutions Inc. Pinckney, MI	N/A	Radiosynthesizer
pH strips 2.0 – 9.0	EMD Millipore	1.09584.0001
Potassium carbonate	Sigma-Aldrich	367877	99.995%
Quaternary methylammonium light cartridge	Waters	186004051	Sep-Pak QMA light
Semi-preparative C18 HPLC column	Phenomenex	00D-4253-N0	100 × 10 mm
Semi-preparative chiral HPLC column	Sigma-Aldrich	12034AST	Astec CHIROBIOTIC T, 25 cm × 10 mm
Sodium chloride injection 23.4%	APP Pharmaceutical, LLC	18730	USP grade
Sodium chloridei injection 0.9%	Hospira	NDC 0409-4888-10	USP grade
Sodium hydroxide	Honeywell	306576	99.99%
Spinal needle, 20 G x 3 ½	Becton-Dickinson & Co.	405182
Sterile alcohol prep pads	BioMed Resource Inc.	PC661
Sterile empty vials, 2 mL	Hollister Stier	7505ZA	13 mm closure
Sterile empty vials, 30 mL	Jubilant HollisterStier	7520ZA	20 mm closure
Syringe PP/PE, 3 mL, Luer Lock	Air-Tite	4020-X00V0
Syringe PP/PE, 5 mL, Luer Lock	Becton-Dickinson & Co.	309646
Syringe,  PP/PE, 10 mL, NORM-JECT	Air-Tite	4100-000V0
Syringe, 1 mL, Luer Slip	Becton-Dickinson & Co.	309659
Syringe, 3 mL, Luer-Lock	Becton-Dickinson & Co.	309657
Ultra high purity argon	Airgas	AR UHP300	99.999%
Ultrapure water	MilliporeSigma	ZRQSVP300	Direct-Q 3 tap to pure and ultrapure water purification system