Denne protokol beskriver brugen af kommercielle, cellefrie proteinekspressionssæt til fremstilling af membranproteiner understøttet i nanodisk, der kan bruges som antigener i underenhedsvacciner.
Underenhedsvacciner giver fordele i forhold til mere traditionelle inaktiverede eller svækkede helcelleafledte vacciner i sikkerhed, stabilitet og standardfremstilling. For at opnå en effektiv proteinbaseret underenhedsvaccine skal proteinantigenet ofte vedtage en native-lignende konformation. Dette er især vigtigt for patogenoverfladeantigener, der er membranbundne proteiner. Cellefrie metoder er med succes blevet anvendt til at producere korrekt foldet funktionelt membranprotein gennem co-oversættelse af nanolipoproteinpartikler (NLP’er), almindeligvis kendt som nanodiske.
Denne strategi kan bruges til at producere underenhedsvacciner bestående af membranproteiner i et lipidbundet miljø. Imidlertid er cellefri proteinproduktion ofte begrænset til lille skala (<1 ml). Mængden af protein, der produceres i små produktionsserier, er normalt tilstrækkelig til biokemiske og biofysiske undersøgelser. Den cellefrie proces skal dog skaleres op, optimeres og omhyggeligt testes for at opnå nok protein til vaccinestudier i dyremodeller. Andre processer, der er involveret i vaccineproduktion, såsom oprensning, tilsætning af adjuvans og lyofilisering, skal optimeres parallelt. Dette papir rapporterer udviklingen af en opskaleret protokol til at udtrykke, rense og formulere en membranbundet proteinunderenhedsvaccine.
Opskalerede cellefrie reaktioner kræver optimering af plasmidkoncentrationer og -forhold, når der anvendes flere plasmidekspressionsvektorer, lipidudvælgelse og adjuvanstilsætning til produktion på højt niveau af formulerede nanolipoproteinpartikler. Metoden demonstreres her med ekspression af et chlamydial major ydre membranprotein (MOMP), men kan anvendes bredt på andre membranproteinantigener. Antigeneffektivitet kan evalueres in vivo gennem immuniseringsundersøgelser for at måle antistofproduktion, som demonstreret her.
Prokaryote eller eukaryote lysater til cellefri ekspression af proteiner er let tilgængelige som kommercielle produkter til syntetisering af proteiner af interesse (for en fuldstændig gennemgang, se 1). Disse ekspressionssystemer er tilgængelige i forskellige skalaer og udnytter lysater fra forskellige organismer, herunder E. coli, tobaksplanter og pattedyrkulturer. Cellefri lysater tilbyder flere fordele i forhold til traditionelle rekombinante proteinproduktionsmetoder, herunder brugervenlighed og robust, hurtig proteinproduktion. Mens disse tilgange primært bruges til at producere opløselige proteiner, har denne gruppe været banebrydende for en tilgang til deres anvendelse til at udtrykke membranproteiner.
Denne nye tilgang foretager mindre ændringer af eksisterende cellefrie ekspressionssystemer ved at inkludere DNA, der koder for to proteinprodukter til ekspression, et apolipoprotein og membranproteinet af interesse. Det udtrykte apolipoprotein (derivater af enten ApoA1 eller ApoE4) interagerer med lipider tilsat til det cellefrie lysat for spontant at samle (~ 20 nm) NLP’er. Når det oversættes sammen med et membranprotein af interesse, danner NLP og membranproteinet et opløseligt nanopartikelkompleks, hvori membranproteinet er indlejret i NLP-lipiddobbeltlaget. Således er membranproteinet mere tilgængeligt til downstream-applikationer, da det er indeholdt i opløselige, diskrete partikler. Denne tilgang kan producere funktionelle oligomere proteinkomplekser inden for NLP-dobbeltlag2 og kan producere antigenkomponenten i en underenhedsvaccine, som efterfølgende blandes med lipofile adjuvanser til dannelse af en nanopartikelvaccine med co-lokaliseret antigen og adjuvans egnet til in vivo-vurdering .
Denne aktuelle metode er ændret fra en tidligere offentliggjort protokol3. Nøglemodifikationer er fokuseret på opskalering af den cellefrie reaktion og efterfølgende oprensning af protein-NLP-komplekset. En yderligere modifikation indbefatter tilsætning af en amfifil polymer kendt som en telodendrimer, som først blandes med lipiderne før tilsætning til den cellefrie reaktion. Co-oversættelse af plasmiderne i nærvær af telodendrimer og lipiderne producerer en telodendrimer NLP (tNLP). Tilsætningen af telodendrimer hjælper også med at modulere størrelsen og monodispersiteten af de resulterende tNLP nanopartikler4. Denne protokol er specifikt optimeret til store vaccinestudier til fremstilling af et membranbundet underenhedsantigenprotein, chlamydial MOMP 5,6. Metoden producerer rekombinant MOMP forbundet med tNLP til dannelse af et meget opløseligt MOMP-tNLP-kompleks, der bevarer MOMP-oligomerisering. En typisk 3 ml opskaleringsproduktion giver >1,5 mg renset MOMP. Den cellefri producerede MOMP-tNLP kan hurtigt tilsættes adjuvans til in vivo immunogenicitetstest.
Klamydia er den mest almindelige seksuelt overførte infektion, der påvirker både mænd og kvinder. Selvom vaccineforskning på klamydia spænder over årtier, er en sikker og effektiv vaccine, der kan skaleres til masseproduktion, forblevet undvigende13. Chlamydial MOMP betragtes som hovedkandidat som et beskyttende vaccineantigen; MOMP er dog meget hydrofob og tilbøjelig til forkert foldning14,15. Yderligere undersøgelser har afsløret, at MOMP findes i oligomere tilstande, der er afgørende for dets immunogenicitet11. Detaljeret her er en valideret, cellefri co-ekspressionsmetode, der producerer oligomere MOMP dannet i tNLP nanopartikel som en vaccine med udbytter på ca. 1,5 mg renset MOMP pr. 3 ml lysat. Denne fuldt indsamlede procedure kan skaleres yderligere til industriel produktion, hvilket øger udsigterne som en nyttig tilgang til generering af vacciner.
Vi har tidligere publiceret om brugen af cellefri ekspression til at producere membranproteiner indlejret i NLP’er 3,16, samt ekspression i telodendrimer-stabiliserede skiver. Denne sidstnævnte teknik producerede imidlertid membranproteinpartikler med større heterogenitet og lavere opløselighed. 4 Derudover er immunogeniciteten af MOMP-telodendrimerpartikler uklar sammenlignet med MOMP-tNLP-partikler6.
Denne procedure kan tilpasses til at opskalere ekspressionen af bakterielle membranproteiner, der er lovende kandidater som antigener til brug i underenhedsvacciner. Ikke alene producerer denne procedure opløseligt bakteriemembranprotein, men den overordnede nanopartikelstruktur kan ændres yderligere ved hjælp af en række lipofile vaccineadjuvanser, herunder, men ikke begrænset til, CpG konjugeret til en kolesteroldel eller FSL-1. Ekspression af andre kandidatantigener fra bakterier er mulig, selvom parametre som ekspressionstemperatur, lipidvalg og type ekspressionssystem muligvis skal undersøges for at opnå optimale udbytter.
Derudover er plasmidvalg og -forhold afgørende i denne proces. Begge anvendte plasmider skal konstrueres fra samme rygrad. Hvis indsatserne er omtrent samme længde, kan forholdene baseres på massen af det tilsatte plasmid som beskrevet her. Imidlertid vil forhold baseret på mol give mere reproducerbare resultater, især ved skalering af reaktionerne. Forhold, der fungerer godt i skærmskalareaktioner (< 0,5 ml), gælder muligvis ikke for større reaktioner og kan kræve yderligere optimering. Ikke-membranproteiner kan stadig udtrykkes ved hjælp af cellefrie kits, men kræver muligvis ikke lipidnanopartiklen (co-ekspression) for at producere et opløseligt produkt. Derudover, mens denne protokol beskriver adjuvans med CpG og FSL-1, er dette system egnet til formulering med andre lipofile adjuvanser eller blanding med opløselige adjuvanser efter ønske.
Det er vigtigt at undgå kontaminering, når den cellefrie ekspressionsreaktion opsættes, da dette kan påvirke udbyttet. Eventuelle tilsætningsstoffer til reaktionen, herunder plasmiderne selv, bør være meget rene. Derudover bør de udtrykte proteiner kun være i kontakt med materialer og opløsninger, der er fri for endotoksinforurening. Endotoksinforurening i kandidatformuleringer kan føre til inkonsekvente og falske resultater af immunologiske assays og kan være skadelige i tilstrækkelige mængder. Selvom det ikke er beskrevet her, kan yderligere oprensning efter nikkelaffinitetskromatografi være nødvendig, hvis mange forurenende stoffer observeres i efterfølgende analysetrin, såsom gennem SDS-PAGE. Dette kan opnås med SEC, selvom forholdene kan kræve optimering på formuleringsbasis.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Public Health Service tilskud R21 AI20925 og U19 AI144184 fra National Institute of Allergy and Infectious Diseases. Dette arbejde blev udført i regi af U.S. Department of Energy af Lawrence Livermore National Laboratory under kontrakt DE-AC52-07NA27344 [LLNL-JRNL-822525, LLNL-VIDEO-832788].
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) as powder | Avanti Polar Lipids | 850345 | |
1.5 mL endotoxin-free centrifuge tubes | Eppendorf | 2600028 | |
1 M Trizma hydrochloride solution | Millipore Sigma | T2194 | |
Acetic acid, glacial, ACS reagent, ≥99.7% | Millipore Sigma | 695092 | |
Bio-Dot apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
Buffer Dam for XCell SureLock | Life Technologies | EI0012 | |
C24 Incubator shaker | New Brunswick Scientific | ||
Cell-Free Expression System: RTS 500 ProteoMaster E. coli HY Kit | BiotechRabbit | BR1400201 | |
cOmplete His-Tag Purification Resin | Roche Molecular Diagnostics | 5893682001 | |
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche Molecular Diagnostics | 4693132001 | |
CpG-ODN1826 | Biosearch Technologies | T9449 | |
D-(+)-Trehalose dihydrate | Millipore Sigma | 71509 | |
Dialysis tubes D-Tube Dialyzer Maxi | Millipore Sigma | 71508-3 | |
Disposable, polypropylene fritted columns 10 mL capacity | Bio-Rad | 7311550EDU | |
Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (PBS) | Millipore Sigma | D8537 | |
Electrophoresis Power Supply | |||
Endosafe PTS cartridge | Thermo Fisher Scientific | NC9594798 | |
Endosafe-PTS Testing System | Charles River | ||
Gel wash solution: 10% methanol, 7% acetic acid | |||
HCl and NaOH solutions for pH adjustment | |||
HPLC with UV-vis diode array detector | Shimadzu | ||
HyClone HyPure culture-grade water | VWR | 82007-328 | |
iBlot 2 Dry Blotting System | Life Technologies | ||
iBlot 2 Transfer Stacks, PVDF | Life Technologies | IB24001 | |
Image Studio V2.0 software | Li-COR Biiosciences | ||
Imidazole | Millipore Sigma | I5513 | |
Immun-Blot PVDF Membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
LI-COR Odyssey Fc imager | Li-COR Biiosciences | ||
Lyophilizer | Labconco | ||
Methanol (≥99.9%) | Millipore Sigma | 34860 | |
Microcentrifuge | |||
Microwave oven | |||
NanoDrop One/OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm | Life Technologies | NP0321 | |
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | NP0007 | |
NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Life Technologies | NP000202 | |
NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) | Life Technologies | NP0009 | |
Odyssey Blocking Buffer in TBS containing 0.2% Tween 20 | Li-COR Biosciences | 927-50000 | |
Orbital Shaker | |||
PBS-T (1x PBS, 0.2% Tween 20, pH 7.4) | |||
PEG5K-CA8 Telodendrimer (custom synthesis product) | |||
pIVEX2.4d vector | Roche Molecular Diagnostics | ||
Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12162 | |
Primary antibody: MAb40 (monoclonal antibody to the variable domain 1 (VD1) of C. muridarum MOMP, de la Maza laboratory)4 | |||
Primary antibody: MAbHIS, Penta-His antibody | Qiagen | 34660 | |
Probe sonicator | |||
Qubit 3.0 Fluorometer | Life Technologies | Q33216 | |
Qubit Protein Assay Kit | Life Technologies | Q33212 | |
Rainin Pipette tips: LTS 1000 µL | Rainin | 17002428 | |
Rainin Pipette tips: LTS 20 µL | Rainin | 17002429 | |
Rainin Pipette tips: LTS 200 µL | Rainin | 17002426 | |
Rainin Pipettes | Rainin | ||
Secondary antibody: IRDye 800CW goat (polyclonal) anti-mouse IgG (heavy and light) | Li-COR Biosciences | 926-32210 | |
SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard | Life Technologies | LC5925 | |
Sodium chloride NaCl | Millipore Sigma | S7653 | |
Sodium phosphate monobasic NaH2PO4 | Millipore Sigma | S0751 | |
Superdex 200, 5/150 GL column | Cytiva | GE28-9909-45 | |
Synthetic diacylated lipoprotein-TLR2/6 FSL-1 | Invivogen | tlrl-fsl | |
SYPRO Ruby Protein Gel Stain | Life Technologies | S12001 | |
TWEEN 20 | Millipore Sigma | P1379 | |
UV light source | |||
Vacufuge Bench Top Centrifuge | Eppendorf | ||
Vortexer | |||
VWR 15 mL conicals (89039-666) | VWR | ||
VWR 50 mL conicals (89039-656) | VWR | ||
XCell SureLock Mini-Cell (Life Technologies ) | Life Technologies | EI0001 |