यह प्रोटोकॉल संयुक्त कॉन्फोकल और एसटीईडी माइक्रोस्कोपी द्वारा न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों के मोर्फोमेट्रिक विश्लेषण के लिए एक विधि का वर्णन करता है जिसका उपयोग एसएमए और कोलक्यू से संबंधित सीएमएस के माउस मॉडल में पैथोलॉजिकल परिवर्तनों को निर्धारित करने के लिए किया जाता है।
न्यूरोमस्कुलर जंक्शन (एनएमजे) निचले मोटर न्यूरॉन्स और कंकाल की मांसपेशी फाइबर के बीच अत्यधिक विशिष्ट सिनैप्स हैं जो तंत्रिका तंत्र से स्वैच्छिक मांसपेशियों तक अणुओं के संचरण में एक आवश्यक भूमिका निभाते हैं, जिससे संकुचन होता है। वे कई मानव रोगों में प्रभावित होते हैं, जिनमें विरासत में मिले न्यूरोमस्कुलर विकार जैसे ड्यूचेन मस्कुलर डिस्ट्रॉफी (डीएमडी), जन्मजात मायस्थेनिक सिंड्रोम (सीएमएस), स्पाइनल मस्कुलर एट्रोफी (एसएमए), और एमियोट्रोफिक लेटरल स्केलेरोसिस (एएलएस) शामिल हैं। इसलिए, न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों की आकृति विज्ञान की निगरानी और रोग माउस मॉडल में उनके परिवर्तन पैथोलॉजिकल अध्ययन और चिकित्सीय दृष्टिकोण के प्रीक्लिनिकल मूल्यांकन के लिए एक मूल्यवान उपकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं। यहां, म्यूरिन टीज्ड मांसपेशी फाइबर से मोटर एंडप्लेट के पूर्व और पोस्टसिनेप्टिक भागों के त्रि-आयामी (3 डी) आकृति विज्ञान को लेबल करने और विश्लेषण करने के तरीकों का वर्णन किया गया है। नमूने तैयार करने और कॉन्फोकल इमेजिंग द्वारा एनएमजे की मात्रा, क्षेत्र, टोर्टुओसिटी और एक्सॉन टर्मिनल आकृति विज्ञान / अधिभोग को मापने की प्रक्रियाएं, और सुपर-रिज़ॉल्यूशन उत्तेजित उत्सर्जन कमी (एसटीईडी) माइक्रोस्कोपी द्वारा पोस्टसिनेप्टिक जंक्शनल सिलवटों और एसिटाइलकोलाइन रिसेप्टर (एसीएचआर) पट्टी चौड़ाई के बीच की दूरी विस्तृत है। इन एनएमजे मापदंडों में परिवर्तन एसएमए और सीएमएस से प्रभावित उत्परिवर्ती चूहों में चित्रित किए गए हैं।
न्यूरोमस्कुलर जंक्शन (एनएमजे) एक जटिल संरचना है जो मोटर एक्सॉन टर्मिनल, एक पेरिसिनेप्टिक श्वान सेल और एक कंकाल मायोफिबर भाग से बना है जो रासायनिक जानकारी के संचरण और मांसपेशियों के संकुचन के लिए कम मोटर न्यूरॉन गतिविधि के युग्मन में शामिल है। स्तनधारियों में, न्यूरोमस्कुलर जंक्शन की आकृति विज्ञान विकास के दौरान बदल जाता है, परिपक्वता के बाद एक विशिष्ट प्रेट्ज़ेल जैसे आकार को अपनाता है, प्रजातियों के बीच आकार और जटिलता में अंतर के साथ, और व्यायाम या उम्र बढ़ने जैसी शारीरिक प्रक्रियाओं के जवाब में कुछ हद तक प्लास्टिसिटी दिखाता है 1,2,3,4 . पोस्टसिनेप्टिक मोटर एंडप्लेट जंक्शनल सिलवटनामक झिल्ली इनवेजाइनेशन बनाता है, जहां एसिटाइलकोलाइन रिसेप्टर्स (एसीएचआर) युक्त ऊपरी हिस्सा प्रीसिनेप्टिक टर्मिनल एक्सॉन शाखा5 के साथ निकट संपर्क में होता है।
न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों में रूपात्मक और कार्यात्मक परिवर्तन कई न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों जैसे स्पाइनल मस्कुलर एट्रोफी (एसएमए) और एमियोट्रोफिक लेटरल स्केलेरोसिस (एएलएस), मायोपैथी जैसे ड्यूशेन मस्कुलर डिस्ट्रॉफी (डीएमडी), जन्मजात मायस्थेनिक सिंड्रोम (सीएमएस), मायास्थेनिया ग्रेविस (एमजी) और सेंट्रोन्यूक्लियर मायोपैथिस (सीएनएम), और उम्र बढ़ने से जुड़े सरकोपेनिया 3,6,7,8,9, 10,11,12. इन रोगों में, एनएमजे संरचनात्मक परिवर्तन जैसे एंडप्लेट विखंडन, कम पोस्टसिनेप्टिक जंक्शनल फोल्ड आकार और / या डीनेरवेशन देखा जाता है। एनएमजे की विकृति रोग की प्रगति के दौरान एक प्राथमिक या प्रारंभिक घटना हो सकती है या नैदानिक अभिव्यक्तियों में योगदान देने वाली द्वितीयक घटना के रूप में अधिक हाल ही में दिखाई देती है। किसी भी मामले में, इन रोगों के पशु मॉडल में एनएमजे की आकृति विज्ञान की निगरानी पैथोलॉजिकल परिवर्तनों का अध्ययन करने और संभावित उपचारों की प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए एक मूल्यवान पैरामीटर का प्रतिनिधित्व करती है।
न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों की आकृति विज्ञान का विश्लेषण आमतौर पर कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी 2,13,14,15 या इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 5,16 का उपयोग करके तकनीकों द्वारा किया जाता है, जिसमें क्रमशः संकल्प या तकनीकी कठिनाइयों जैसी उनकी अंतर्निहित सीमाएं होती हैं। हाल ही में, सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी का उपयोग एनएमजे के विशेष क्षेत्रों की कल्पना करने के लिए भी किया गया था, जैसे कि प्रीसिनेप्टिक सक्रिय क्षेत्र या पोस्टसिनेप्टिक झिल्ली 16,17,18 पर एसीएचआर वितरण, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा अल्ट्रास्ट्रक्चरल विश्लेषण के लिए एक वैकल्पिक या पूरक दृष्टिकोण के रूप में।
इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य फ्लोरेसेंस कॉन्फोकल और उत्तेजित उत्सर्जन कमी (एसटीईडी) माइक्रोस्कोपी के संयोजन से एनएमजे रूपात्मक मापदंडों का आकलन करने के लिए एक विस्तृत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि प्रदान करना है। प्रीसिनेप्टिक और पोस्टसिनेप्टिक एंडप्लेट की महत्वपूर्ण विशेषताएं, जैसे वॉल्यूम, क्षेत्र, सापेक्ष टॉर्टुओसिटी, एसीएचआर पट्टी चौड़ाई, और माउस गैस्ट्रोकेनेमस और टिबियलिस एंटीरियर के आंतरिक टेड टीज मांसपेशी फाइबर में एक्सॉन टर्मिनल वितरण को सामान्य और रोगग्रस्त स्थितियों के संदर्भ में निर्धारित किया गया था। विशेष रूप से, एनएमजे दोषों को स्पाइनल मस्कुलर एट्रोफी के एसएमएन2 बी / – माउस मॉडल में उदाहरण दिया गया था, जो एसएमएन 1 जीन 11,19 में उत्परिवर्तन के कारण मोटर न्यूरॉन अपघटन के साथ एक न्यूरोमस्कुलर बीमारी है, और एसिमेट्रिक एसिटाइलकोलिनेस्टरेज़ नॉकआउट (कोलक्यूडेक्स 2 / डेक्स 2 या कोलक्यू-केओ) चूहों के कोलेजन जैसी पूंछ सबयूनिट में, जन्मजात मायस्थेनिक सिंड्रोम20 के मॉडल के रूप में। 21,22.
वर्णित वीडियो प्रोटोकॉल कॉन्फोकल और एसटीईडी माइक्रोस्कोपी के संयोजन से न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों की 3 डी संरचना को निर्धारित करने के लिए एक विस्तृत विधि प्रदान करता है जिसका उपयोग पूर्व और पोस्टसिनेप्टिक स्तरों पर पैथोलॉजिकल परिवर्तनों को चिह्नित करने के लिए किया जा सकता है। एसटीईडी माइक्रोस्कोपी का उच्च रिज़ॉल्यूशन नैनोस्ट्रक्चर के विज़ुअलाइज़ेशन और मोर्फोमेट्रिक विश्लेषण की अनुमति देता है जो पारंपरिक कॉन्फोकल इमेजिंग द्वारा पहचाने जाने योग्य नहीं हैं। इस प्रक्रिया ने हमें एसएमए और कोलक्यू से संबंधित सीएमएस चूहों के दो एपेंडिसुलर मांसपेशियों, टिबियलिस एंटीरियर और गैस्ट्रोकेनेमस में एनएमजे के संरचनात्मक परिवर्तनों को मापने में सक्षम बनाया।
इस तकनीक के साथ विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए, मांसपेशियों को ठीक से विच्छेदित और चिढ़ाना महत्वपूर्ण है, मांसपेशियों के आसपास के प्रावरणी पर विशेष ध्यान देना और मांसपेशियों के बंडलों को अलग करने के लिए लागू ताकत; अन्यथा, संक्रमण पैटर्न को उचित प्रीसिनेप्टिक एनएमजे मूल्यांकन में बाधा डालने के लिए बाधित किया जा सकता है। यद्यपि टीए और जीए से एनएमजे का विश्लेषण करने के लिए विस्तृत जानकारी प्रदान की जाती है, सिद्धांत रूप में, इस प्रोटोकॉल को अन्य मांसपेशियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जिसमें फ्लैट मांसपेशियां शामिल हैं, जैसे कि डायाफ्राम या ट्रांसवर्स एब्डोमिनिस37, जिन्हें चिढ़ाने के कदम की आवश्यकता नहीं होती है। अच्छी गुणवत्ता वाले धुंधलापन सुनिश्चित करने के लिए ऊतक निर्धारण भी महत्वपूर्ण है; इसलिए, उचित मात्रा (मांसपेशियों के 15-20 गुना) पर उच्च गुणवत्ता वाले पीएफए का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। इसके अलावा, फिक्सेटिव के लिए एक्सपोजर समय एक महत्वपूर्ण कदम है क्योंकि कलाकृतियां, जैसे संकोचन और झुरमुट, अति-निर्धारण के कारण दिखाई दे सकती हैं और एनएमजे सुविधाओं को प्रभावित कर सकती हैं। नमूनों के आकार औरऊतकों 38 में पैराफॉर्मलडिहाइड समाधान की प्रवेश दर को देखते हुए, इस प्रकार की मांसपेशियों के लिए 18-24 घंटे के निर्धारण समय की सिफारिश की जाती है। यदि ऊतक कटाई के एक सप्ताह से अधिक समय बाद धुंधला कदम की योजना बनाई जाती है, तो बैक्टीरिया के प्रसार को रोकने के लिए पीबीएस में पीएफए-निश्चित मांसपेशियों को सोडियम एज़ाइड के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर पूरक रखने का सुझाव दिया जाता है।
यह प्रोटोकॉल कॉन्फोकल के लिए α-बीटीएक्स-एफ 488 और एसटीईडी इमेजिंग के लिए α-बीटीएक्स-एफ 633 का उपयोग करके एक दृष्टिकोण प्रस्तुत करता है। इन फ्लोरोफोरे को वर्णित प्रयोगात्मक डिजाइन के साथ फिट करने के लिए चुना गया था, लेकिन उपलब्ध उपकरणों और सामग्रियों के अनुसार संशोधित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, छवि अधिग्रहण और परिमाणीकरण के लिए एसटीईडी सीडब्ल्यू 592 एनएम लेजर का उपयोग करते समय α-बीटीएक्स एफ 488 लेबलिंग का चयन किया जा सकता है। हालांकि, ऐसा प्रतीत होता है कि वर्तमान अध्ययन (स्पंदित उत्तेजना गेटेड एसटीईडी, 775 एनएम कमी) में लागू किया गया विन्यास अन्य दृष्टिकोणों की तुलना में उच्च प्रदर्शन और बेहतर रिज़ॉल्यूशन प्रदर्शित करता है, जैसे कि निरंतर तरंग एसटीईडी39, जिससे यह वर्तमान आवेदन के लिए अधिक उपयुक्त हो जाता है। लेजर पावर सेटिंग्स को ध्यान से चुनना भी महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से एसटीईडी (उत्तेजना और कमी दोनों) के लिए, क्योंकि संतृप्ति के मामले में तीव्रता प्रोफ़ाइल की विशेषताओं को मापा नहीं जा सकता है, और इसलिए एनएमजे छवि में कोई भी संतृप्त संकेत पूरे विश्लेषण को खतरे में डाल सकता है।
माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर और इमेजजे मैक्रोज़ का उपयोग करके छवि अधिग्रहण और विश्लेषण सहित यह विस्तृत वर्कफ़्लो, एक मांसपेशी से कॉन्फोकल और एसटीईडी माइक्रोस्कोपी द्वारा स्वायत्त एनएमजे मोर्फोमेट्रिक विश्लेषण की सुविधा के लिए विकसित किया गया था। एनएमजे कॉनफोकल विश्लेषण के लिए पहले वर्णित वर्कफ़्लो, जैसे एनएमजे-मॉर्फ2 या एनएमजे-एनालाइजर14, ने अर्ध-स्वचालित तरीकों के डिजाइन के लिए मार्ग प्रशस्त किया जो एनएमजे के रूपात्मक विश्लेषण और तुलनात्मक अध्ययन की सुविधा प्रदान करते हैं। एनएमजे-मॉर्फ (और इसका अद्यतन संस्करण एएनएमजे-मॉर्फ15) एक मुफ्त इमेजजे-आधारित मंच है जो 21 रूपात्मक विशेषताओं को मापने के लिए अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण का उपयोग करता है, और एनएमजे-एनालाइजर पायथन में विकसित एक स्क्रिप्ट का उपयोग करता है जो पूरे 3 डी एनएमजे संरचना से 29 प्रासंगिक पैरामीटर उत्पन्न करता है। मैन्युअल थ्रेशोल्डिंग इन दो विधियों में छवि प्रसंस्करण के दौरान एकमात्र चरण है जिसके लिए उपयोगकर्ता विश्लेषण की आवश्यकता होती है। यह एकीकृत प्रोटोकॉल ऊतक तैयार करने, 3 डी कॉन्फोकल छवि अधिग्रहण, और पूरे कंकाल की मांसपेशियों से एनएमजे के इमेजजे-आधारित प्रसंस्करण के लिए चरणों का विवरण देता है और पोस्टसिनेप्टिक (वॉल्यूम, अधिकतम प्रक्षेपण क्षेत्र, और टॉर्टुओसिटी) और प्रीसिनेप्टिक (एक्सॉन टर्मिनल अधिभोग और न्यूरोफिलामेंट संचय) एंडप्लेट के पांच महत्वपूर्ण मापदंडों का सरलीकृत अवलोकन प्रदान करता है। जैविक प्रासंगिकता का एक अतिरिक्त पैरामीटर, पोस्टसिनेप्टिक जंक्शनल सिलवटों का एसीएचआर संगठन पैटर्न, सुपर-रिज़ॉल्यूशन एसटीईडी माइक्रोस्कोपी (रिज़ॉल्यूशन 20-30 एनएम) 40 द्वारा नैनोस्केल स्तर पर मोर्फोमेट्रिक विश्लेषण के लिए शामिल किया गया था। दिलचस्प बात यह है कि एसटीईडी इमेजिंग के लिए ऊतक तैयारी एनएमजे अल्ट्रास्ट्रक्चरल अध्ययनों के लिए उपयोग किए जाने वाले अन्य तरीकों की तुलना में सरल है, जैसे कि पारंपरिक ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) 9, जो एक जटिल और समय लेने वाली प्रक्रिया है जिसे उपयुक्त मांसपेशी क्षेत्र के अल्ट्राथिन वर्गों को प्राप्त करने के लिए एक कुशल मैनिपुलेटर की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, एसटीईडी से जुड़े सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके कई जंक्शन सिलवटों से मात्रात्मक डेटा स्वचालित रूप से प्राप्त किया जा सकता है।
यह प्रोटोकॉल एसएमएन और कोलक्यू की कमी वाली मांसपेशियों 20,36,41,42 में पहले से ज्ञात एनएमजे दोषों को चित्रित करने के लिए लागू किया गया था। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा दो माउस मॉडल में सामान्य परिवर्तन पाए गए, जैसे कि पोस्टसिनेप्टिक एंडप्लेट वॉल्यूम, एमआईपी क्षेत्र, और सापेक्ष टॉर्टुओसिटी में कमी, और न्यूरोफिलामेंट संचय में वृद्धि, जबकि कुछ और विशिष्ट निष्कर्ष (एनएमजे अधिभोग में कमी), केवल एसएमए चूहों में देखे गए थे, बिगड़ा हुआ पुटिका तस्करी36 के संकेतक के रूप में। अंत में, एसटीईडी विश्लेषण द्वारा कोलक्यू-केओ में एसीएचआर पट्टी दूरी और चौड़ाई में वृद्धि का पता लगाया गया था, जो पोस्टसिनेप्टिक जंक्शनल सिलवटों में अल्ट्रास्ट्रक्चरल दोषों के संकेत हैं, जैसा कि पहले टीईएम20 द्वारा देखा गया था। महत्वपूर्ण रूप से, यह प्रोटोकॉल विकास, रखरखाव और विभिन्न रोग स्थितियों के तहत न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों के अधिक गहन रूपात्मक लक्षण वर्णन में मदद कर सकता है।
The authors have nothing to disclose.
हम जेनेथन की “इमेजिंग और साइटोमेट्री कोर सुविधा” के साथ-साथ हिस्टोलॉजी सेवा को धन्यवाद देते हैं, जो क्षेत्र इले-डी-फ्रांस, कंसिल जनरल डी एल’एसोने, जेनोपोल रेचरचे ऑफ एवरी, यूनिवर्सिटी ऑफ एवरी वैल डी’एससोन और आईएनएसईआरएम, फ्रांस से उपकरण निधि द्वारा समर्थित हैं। हम एसएमएन2 बी / 2 बी माउस लाइन (ओटावा विश्वविद्यालय, कनाडा) और डॉ एरिक क्रेजी को कोलक्यूडेक्स 2 / + माउस लाइन (अप्रकाशित, पेरिस विश्वविद्यालय, फ्रांस) प्रदान करने के लिए डॉ रश्मि कोथारी के भी आभारी हैं। हम सांख्यिकीय विश्लेषण में उनके समर्थन के लिए गिलाउम कोरे को धन्यवाद देते हैं। 2एच3 (जेसेल, टीएम और डोड, जे द्वारा विकसित) और एसवी 2 (बकले, केएम द्वारा विकसित) मोनोक्लोनल एंटीबॉडी एनआईएच के एनआईसीएचडी द्वारा बनाए गए डेवलपमेंटल स्टडीज हाइब्रिडोमा बैंक (डीएसएचबी) से प्राप्त किए गए थे और आयोवा विश्वविद्यालय, जीव विज्ञान विभाग, आयोवा सिटी, आईए 52242 में बनाए गए थे। इस काम को एसोसिएशन फ्रैंकाइज़ कॉन्ट्रे लेस मायोपैथिस (एएफएम-टेलीथॉन), आईएनएसईआरएम और इवरी वैल डी’एससोन विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था।
Buffers and Reagents | |||
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (F488) | Life Technologies, Thermofisher | A-11001 | |
Alexa Fluor 488 α-bungarotoxin (F488-a-BTX) | Life Technologies, Thermofisher | B13422 | |
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG (F594) | Life Technologies, Thermofisher | A-11032 | |
ATTO-633 α-bungarotoxin (F633-a-BTX) | Alomone Labs | B-100-FR | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
DAPI Fluoromount-G | Southern Biotech | 00-4959-52 | |
DPBS | Gibco, Invitrogen | 14190-169 | |
Ethanol Absolute | VWR | 20821.296 | |
Immersion Oil, n = 1.518 | THORLABS | MOIL-10LF | Low autofluorescence |
Neurofilament (NF-M) antibody | DSHB | AB_531793 | |
Paraformaldehyde (PFA) | MERCK | 1.04005 | |
Synaptic vesicle glycoprotein 2 (SV2) antibody | DSHB | AB_2315387 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
Materials | |||
Alnico Button cylindrical magnets | Farnell France | E822 | diameter of 19.1 mm with maximal pull of 1.9 Kg |
63x 1.4 NA magnitude oil immersion HCX Plan Apo CS objective | Leica Microsystems | ||
100x 1.4 NA HC PL APPO CS2 Objective | Zeiss | ||
Curved thin forceps-Moria iris forceps | Fine Science Tools | 11370-31 | |
Extra thin scissors – Vannas-Tübingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15-003-08 | |
Fine serrated forceps | Euronexia | P-95-AA | |
Gel loading tip round 1-200 µL | COSTAR | 4853 | |
Leica laser-scanning confocal microscope TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
Leica Laser-scanning confocal microscope TCS SP8 Gated STED 775 nm | Leica Microsystems | ||
Lens Cleaning Tissue | Whatman (GE Healthcare) | 2105-841 | |
Medium serrated forceps | Euronexia | P-95-AB | |
Microscope cover glasses 24×50 nm No 1.5H 170±5 µm | Marienfield | 107222 | High precision |
Nunclon delta surface (12-well plates) | Thermo Scientific | 150628 | |
Nunclon delta surface (24-well plates) | Thermo Scientific | 142475 | |
Safeshield scalpel | Feather | 02.001.40.023 | |
Sharp-blunt scissors – fine Scissors – Martensitic Stainless Steel | Fine Science Tools | 14094-11 | |
Superfrost plus slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
Software | |||
GraphPad | Prism, San Diego (US) | Release N°6.07 | Statistical software |
ImageJ software | National Institutes of Health | Release N° 1.53f | |
Leica Application Suite X software | Leica Microsystems | Release N°3.7.2.2283 | Free microscope software available at https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/downloads/ |