目前的方案提出了一种快速、高效和温和的方法,用于从持续生长的小鼠门牙、小鼠臼齿和人类牙齿中分离出适合单细胞RNA-seq分析的单细胞。
小鼠和人类牙齿代表着具有挑战性的器官,用于快速有效地分离单细胞转录组或其他应用。富含细胞外基质的牙髓组织需要漫长而繁琐的解离过程,通常超出了单细胞转录组学的合理时间。为了避免基因表达的人工变化,需要最小化从安乐死动物到分析单个细胞所经过的时间。这项工作提出了一种快速方案,能够以适合scRNA-seq(单细胞RNA测序)的优异质量从小鼠和人类牙齿中获得单细胞悬浮液。该协议基于加速的组织分离步骤,酶消化和随后制备最终的单细胞悬浮液。这样可以快速,温和地处理组织,并允许使用更多的动物或人类样品来获得具有高活力和最小转录变化的细胞悬浮液。预计该协议可能会指导有兴趣不仅在小鼠或人类牙齿上进行scRNA-seq的研究人员,而且在其他细胞外富含基质的组织(包括软骨,致密结缔组织和真皮)上进行scRNA-seq。
单细胞RNA测序是破译 体内 细胞群结构、层次结构、相互作用和稳态的强大工具1,2。然而,其结果在很大程度上取决于这种高级分析的第一步 – 从复杂,组织良好的组织中制备出质量完美的单细胞悬浮液。这包括保持细胞存活并防止细胞基因表达谱中不必要的人为变化3,4。这种变化可能导致对人口结构的不准确描述和对所收集数据的误解。
已经开发了从各种组织中分离出的特定方案5,6,7,8。它们通常采用机械解离,并结合各种蛋白水解酶的进一步孵育。这些通常包括胰蛋白酶,胶原酶,解离,木瓜蛋白酶6,7,8,9或市售的酶混合物,如Accutase,Tryple等。影响转录组质量的最关键部分是酶消化。结果表明,在37°C下与酶长时间孵育会影响基因表达并导致许多应激相关基因的上调10,11,12,13。分离过程的另一个关键参数是其总长度,因为已经表明细胞转录组在组织缺血后会发生变化14。该方案为从小鼠和人牙齿中温和分离单个细胞提供了一种有效的方案,比以前使用的其他从复杂组织中分离细胞的方案更快5,6,9,11,13,15,16。
该协议介绍了如何从硬牙中快速解剖软组织并制备适合scRNA-seq的单细胞悬浮液。该方法仅采用一个离心步骤,并通过减少组织处理和消化时间以及将组织和细胞大部分时间保持在4°C来最小化不需要的转录变化的影响。该程序展示了从小鼠门牙,臼齿和人类智齿中分离细胞作为示例,但主要应该适用于各种生物体中的其他牙齿。完整的协议如图 1 所示。该协议最近已被用于生成从小鼠和人类牙齿获得的牙科细胞类型图谱1。
在细胞或分子水平上研究牙齿和骨骼通常具有挑战性,因为形成这些组织的细胞被不同类型的硬基质包围19。在牙齿组织上进行单细胞RNA-seq的主要目标之一是需要快速获得感兴趣的细胞,并且其转录组没有任何人为的变化。为了实现这一目标,开发了一种适用于从小鼠和人类牙髓中分离细胞的高效方案,其允许快速生成用于所有转录组学应用的单细胞悬浮液。这是通过快速组织分离,最大限度地减少组织和细胞操作的步骤以及简化机械和酶消化来确保的。
该协议最关键的步骤是快速组织处理和足够的单细胞悬浮液制备8,9。手动方法用于获得牙髓,而无需使用牙钻或其他发热装置。过热可能导致热休克蛋白和其他基因的人工表达,最终导致分析的基因表达模式不能代表原始组织20。手动组织采集可能是一个具有挑战性的步骤,可能需要事先进行一些培训。然后将果肉切成小块并在37°C下酶消化。 除了15-20分钟的酶消化外,整个方案在4°C下进行。 组织处理,特别是酶消化被最小化到尽可能短的时间,因为在37°C下更长时间的孵育会导致基因表达模式的变化10。建议在酶消化前机械去除牙本质。牙本质和牙髓附着的牙本质含有大量的胶原蛋白,其过量存在可能会降低消化液的有效性。在从体内移除(或生物体死亡)后,显示细胞开始快速修改其基因表达模式12。因此,应尽快进行细胞分离和处理。目前的方案将处理时间从分离组织(安乐死动物)到制备单细胞悬浮液减少到35-45分钟。
该技术的一种替代修改是细胞保存以供以后使用。这是通过甲醇固定实现的。甲醇固定细胞悬浮液可在-80°C下储存长达1个月,如协议中所述21。然而,只要有可能,直接进行scRNA-seq,因为已经证明来自甲醇固定单细胞悬浮液的单细胞数据可能会受到应激相关基因表达增加和环境RNA22污染的影响。此步骤可能需要根据制造商的协议进行其他修改。
在首次应用此协议之前,建议执行几个验证步骤来测试该技术。根据我们的经验,我们建议测试协议的上述关键步骤。此外,我们建议测试胶原酶P溶液的有效性并测试组织解离步骤的处理。具体而言,在胶原酶P孵育开始后的前5分钟左右,组织碎片应聚集在一起。这是一种常见的情况。使用1 mL移液器每3-4分钟分解一次聚集体,并且随着时间的流逝,它们应该变小直到几乎看不见。
此外,建议在离心前和过滤前后在细胞计数室中进行细胞计数,以检测由于上清液去除次优而可能导致的细胞损失。如果需要纯化最终的单细胞悬浮液,可以使用FACS。细胞分选不仅可以去除碎屑或死细胞,而且重要的是能够用荧光标记的细胞富集最终悬浮液13,19。为了避免剪切应力或细胞分选机堵塞,使用宽喷嘴(85μm或100μm)。这将进一步提高分类细胞的活力。
这项技术是在小鼠和人类牙齿上设计和测试的。主要的限制因素是老年小鼠(臼齿)和人类牙齿的减少牙髓中的细胞数量很少。假设需要获得更多数量的细胞或从老年患者的牙齿中获取细胞。一种可能的解决方案是加工更多数量的牙齿,并将它们合并成一个批次,然后作为一个样品进行处理。
二十多年前,人类牙髓的活细胞首次使用胶原酶I和dispase23的酶混合物分离出来。从那时起,牙髓细胞的分离被广泛使用,并且已经使用了几种技术5,6,7,8。这里介绍的方法的关键意义在于调整所有分离步骤,使分离快速而温和,以确保scRNA-seq的最终细胞悬浮液的高质量。通过更长时间的酶孵育可以获得更高的细胞产量。该方案为从小鼠和人牙齿中快速获得适合单细胞RNA测序的单细胞提供了有效的解决方案。该技术有望广泛用于其他组织或生物体,只需稍作技术修改即可。
The authors have nothing to disclose.
J.K.得到了马萨里克大学资助机构(MUNI/H/1615/2018)以及MU医学院对初级研究员的资助。J.L.得到了马萨里克大学拨款机构(MUNI/IGA/1532/2020)的支持,并且是布尔诺博士人才奖学金获得者 – 由布尔诺市政府资助。T.B.得到了奥地利科学基金的支持(Lise Meitner赠款:M2688-B28)。我们感谢Lydie Izakovicova Holla和Veronika Kovar Matejova在获得人类牙齿方面的帮助。最后,我们感谢Radek Fedr和Karel Soucek在FACS分类方面提供的友好协助。
APC anti-mouse CD45 Antibody | BioLegend | 103112 | |
Bovine Serum Albumin Fraction V | Roche | 10735078001 | |
CellTrics 50 µm, sterile | Sysmex | 04-004-2327 | |
Collagenase P (COLLP-PRO) | Roche | 11213857001 | |
CUTFIX Scalpel Blades, Fig. 10 | AESCULAP | 16600495 | |
CUTFIX Scalpel Blades, Fig. 11 | AESCULAP | 16600509 | |
Fetal Bovine Serum (South America), Ultra low Endotoxin | Biosera | FB-1101/500 | |
Hank's balanced salt solution (HBSS) without Ca2+ and Mg2+ | SIGMA | H6648 | |
Industrial low lint wipes, MAX60 | Dirteeze | MAX60B176 | |
Industrial strong tweezers, style 660, bent serrated pointed tips, 150mm | Value-Tec | 50-014366 | |
Methyl alcohol A.G. | Penta | 21210-11000 | |
Propidium Iodide Solution | BioLegend | 421301 | |
Scalpel handle | CM Instrumente | AG-013-10 | |
Serological pipettes 10mL, individually wrapped, 200 pcs. | CAPP | SP-10-C | |
Stereo microscope | Leica | EZ4 | |
Surgical scissors (9cm) | CM Instrumente | AI-430-09Y | |
Tissue culture dish Ø 100 mm | TPP | 93100 |