वर्तमान प्रोटोकॉल एक लगातार बढ़ते माउस कृंतक, माउस दाढ़ और मानव दांतों से एकल-सेल आरएनए-सेक विश्लेषण के लिए उपयुक्त एकल कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक तेज, कुशल और कोमल विधि प्रस्तुत करता है।
माउस और मानव दांत एकल-सेल ट्रांसक्रिप्टोमिक या अन्य अनुप्रयोगों के लिए त्वरित और कुशल सेल अलगाव के लिए चुनौतीपूर्ण अंगों का प्रतिनिधित्व करते हैं। दंत लुगदी ऊतक, बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स में समृद्ध, एक लंबी और थकाऊ पृथक्करण प्रक्रिया की आवश्यकता होती है जो आमतौर पर एकल-सेल ट्रांसक्रिप्टोमिक्स के लिए उचित समय से परे होती है। जीन अभिव्यक्ति में कृत्रिम परिवर्तनों से बचने के लिए, एक जानवर को euthanizing से गुजरे समय को तब तक जब तक कि एकल कोशिकाओं के विश्लेषण को कम करने की आवश्यकता न हो। यह काम एक तेज प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है जो माउस और मानव दांतों से एकल-सेल निलंबन को scRNA-seq (एकल-सेल आरएनए-अनुक्रमण) के लिए उपयुक्त उत्कृष्ट गुणवत्ता में प्राप्त करने में सक्षम बनाता है। यह प्रोटोकॉल त्वरित ऊतक अलगाव चरणों, एंजाइमेटिक पाचन और अंतिम एकल-सेल निलंबन की बाद की तैयारी पर आधारित है। यह ऊतकों के तेजी से और कोमल प्रसंस्करण को सक्षम बनाता है और उच्च व्यवहार्यता और न्यूनतम ट्रांसक्रिप्शनल परिवर्तनों के साथ सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए अधिक पशु या मानव नमूनों का उपयोग करने की अनुमति देता है। यह अनुमान लगाया जाता है कि यह प्रोटोकॉल न केवल माउस या मानव दांतों पर बल्कि उपास्थि, घने संयोजी ऊतक और डर्मिस सहित अन्य बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स-समृद्ध ऊतकों पर भी एससीआरएनए-सेक करने में रुचि रखने वाले शोधकर्ताओं का मार्गदर्शन कर सकता है।
एकल-सेल आरएनए अनुक्रमण विवो सेल जनसंख्या संरचना, पदानुक्रम, इंटरैक्शन और होमोस्टैसिस 1,2 में समझने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। हालांकि, इसके परिणाम दृढ़ता से इस उन्नत विश्लेषण के पहले चरण पर निर्भर करते हैं – जटिल, अच्छी तरह से संगठित ऊतक से सही गुणवत्ता के एकल-सेल निलंबन की तैयारी। इसमें कोशिकाओं को जीवित रखना और कोशिकाओं के जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल में अवांछित, कृत्रिम परिवर्तनों को रोकना शामिल है3,4। इस तरह के परिवर्तनों से जनसंख्या संरचना के गलत लक्षण वर्णन और एकत्र किए गए डेटा की गलत व्याख्या हो सकती है।
ऊतकों की एक विस्तृत श्रृंखला से बाहर अलगाव के लिए विशिष्ट प्रोटोकॉल विकसित किए गए हैं5,6,7,8। वे आमतौर पर विभिन्न प्रोटियोलिटिक एंजाइमों के साथ आगे के इनक्यूबेशन के साथ संयोजन में यांत्रिक पृथक्करण को नियोजित करते हैं। इनमें आमतौर पर ट्रिप्सिन, कोलेजेनेस, डिस्पैज़, पपेन 6,7,8,9, या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंजाइम मिश्रण जैसे कि Accutase, Tryple, आदि शामिल हैं। ट्रांसक्रिप्टोम की गुणवत्ता को प्रभावित करने वाला सबसे महत्वपूर्ण हिस्सा एंजाइमेटिक पाचन है। यह दिखाया गया था कि 37 डिग्री सेल्सियस पर एंजाइमों के साथ लंबे समय तक इनक्यूबेशन जीन अभिव्यक्ति को प्रभावित करती है और कई तनाव से संबंधित जीनों के अपरेगुलेशन का कारण बनती है10,11,12,13। अलगाव प्रक्रिया का अन्य महत्वपूर्ण पैरामीटर इसकी समग्र लंबाई है, क्योंकि यह दिखाया गया है कि ऊतक ischemia14 के बाद सेल ट्रांसक्रिप्टोम बदल जाते हैं। यह प्रोटोकॉल माउस और मानव दांतों से एकल कोशिकाओं के कोमल अलगाव के लिए एक कुशल प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है, अन्य की तुलना में तेज, जटिल ऊतकों से कोशिकाओं के अलगाव के लिए पहले उपयोग किए गए प्रोटोकॉल5,6,9,11,13,15,16।
यह प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है कि हार्ड दांत से नरम ऊतक को जल्दी से कैसे विच्छेदित किया जाए और एससीआरएनए-सेक के लिए उपयुक्त एकल-सेल निलंबन तैयार किया जाए। यह विधि केवल एक सेंट्रीफ्यूजेशन चरण को नियोजित करती है और ऊतक हैंडलिंग और पाचन समय को कम करके और ऊतक और कोशिकाओं को अधिकांश समय 4 डिग्री सेल्सियस पर रखकर अवांछित ट्रांसक्रिप्शनल परिवर्तनों के प्रभाव को कम करती है। प्रक्रिया एक उदाहरण के रूप में माउस incisors, दाढ़, और मानव ज्ञान दांतों से कोशिकाओं के अलगाव का प्रदर्शन करती है, लेकिन मुख्य रूप से विभिन्न जीवों में अन्य दांतों के लिए काम करना चाहिए। पूरा प्रोटोकॉल योजनाबद्ध रूप से चित्र 1 में विज़ुअलाइज़ किया गया है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग हाल ही में माउस और मानव दांतों से प्राप्त एक दंत कोशिका प्रकार एटलस उत्पन्न करने के लिए किया गया है1।
सेलुलर या आणविक स्तर पर दांतों और हड्डियों का अध्ययन करना आम तौर पर चुनौतीपूर्ण होता है क्योंकि इन ऊतकों को बनाने वाली कोशिकाएं विभिन्न प्रकार के कठोर आव्यूहों से घिरी होती हैं। दंत ऊतक पर एकल-सेल आरएनए-सेक करने के लिए मुख्य लक्ष्यों में से एक तेजी से और उनके ट्रांसक्रिप्टोम में किसी भी कृत्रिम परिवर्तन के बिना ब्याज की कोशिकाओं को प्राप्त करने की आवश्यकता है। इसे पूरा करने के लिए, माउस और मानव दांत लुगदी से कोशिकाओं को अलग करने के लिए उपयुक्त एक अत्यधिक कुशल प्रोटोकॉल विकसित किया गया था, जो सभी ट्रांसक्रिप्टोमिक अनुप्रयोगों के लिए एकल-सेल निलंबन की त्वरित पीढ़ी के लिए अनुमति देता है। यह तेजी से ऊतक अलगाव द्वारा सुनिश्चित किया गया था, ऊतक और सेल जोड़तोड़ के चरणों को कम से कम करने, और यांत्रिक और एंजाइमेटिक पाचन को सुव्यवस्थित करने के लिए।
इस प्रोटोकॉल के सबसे महत्वपूर्ण चरण तेजी से ऊतक प्रसंस्करण और पर्याप्त एकल-सेल निलंबन तैयारी 8,9 हैं। एक मैनुअल दृष्टिकोण का उपयोग दंत ड्रिल या अन्य गर्मी पैदा करने वाले उपकरणों का उपयोग किए बिना दंत लुगदी प्राप्त करने के लिए किया जाता है। ओवरहीटिंग गर्मी सदमे प्रोटीन और अन्य जीनों की कृत्रिम अभिव्यक्ति का कारण बन सकती है, अंततः विश्लेषण किए गए जीन अभिव्यक्ति पैटर्न को मूल ऊतक 20 के गैर-प्रतिनिधि होने के लिए अग्रणी। मैनुअल ऊतक कटाई एक चुनौतीपूर्ण कदम हो सकता है जिसे संभवतः पहले से कुछ प्रशिक्षण की आवश्यकता होगी। लुगदी को फिर छोटे टुकड़ों में काटा जाता है और 37 डिग्री सेल्सियस पर एंजाइमेटिक रूप से पचाया जाता है। एंजाइमेटिक पाचन के 15-20 मिनट को छोड़कर, पूरे प्रोटोकॉल को 4 डिग्री सेल्सियस पर किया जाता है। ऊतक प्रसंस्करण और विशेष रूप से एंजाइमेटिक पाचन को कम से कम संभव समय तक कम से कम किया गया था क्योंकि 37 डिग्री सेल्सियस पर अधिक लंबे समय तक इनक्यूबेशन जीन अभिव्यक्ति पैटर्न में परिवर्तन का कारण बन सकता है। एंजाइमेटिक पाचन से पहले डेंटिन के यांत्रिक हटाने की सिफारिश की जाती है। डेंटिन और लुगदी से जुड़े प्रीडेंटिन में बड़ी मात्रा में कोलेजन होता है, और इसकी अत्यधिक उपस्थिति पाचन समाधान की प्रभावशीलता को कम कर सकती है। शरीर से हटाए जाने के बाद (या जीवों की मृत्यु), यह दिखाया गया था कि कोशिकाएं अपने जीन अभिव्यक्ति पैटर्न को जल्दी से संशोधित करना शुरू कर देती हैं। इसलिए, सेल अलगाव और प्रसंस्करण जितनी जल्दी हो सके किया जाना चाहिए। वर्तमान प्रोटोकॉल एकल-सेल निलंबन तैयार करने के लिए ऊतक (euthanizing पशु) को अलग करने से प्रसंस्करण समय को 35-45 मिनट तक कम कर देता है।
इस तकनीक का एक वैकल्पिक संशोधन बाद में उपयोग के लिए सेल संरक्षण है। यह मेथनॉल निर्धारण द्वारा प्राप्त किया जाता है। मेथनॉल-फिक्स्ड सेल निलंबन को -80 डिग्री सेल्सियस पर 1 महीने तक संग्रहीत किया जा सकता है, जैसा कि प्रोटोकॉल 21 में वर्णित है। हालांकि, जब भी संभव हो, सीधे scRNA-seq करें, क्योंकि यह दिखाया गया था कि मेथनॉल-फिक्स्ड सिंगल-सेल निलंबन से एकल-सेल डेटा तनाव से संबंधित जीन की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति और परिवेश आरएनए 22 के साथ संदूषण से पीड़ित हो सकता है। इस चरण को निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार अतिरिक्त संशोधन की आवश्यकता हो सकती है।
इस प्रोटोकॉल के पहले आवेदन से पहले, तकनीक का परीक्षण करने के लिए कई सत्यापन चरणों का प्रदर्शन करने की सिफारिश की जाती है। हमारे अनुभव से, हम प्रोटोकॉल के उपर्युक्त महत्वपूर्ण चरणों का परीक्षण करने का सुझाव देते हैं। इसके अतिरिक्त, हम कोलेजनेस पी समाधान की प्रभावशीलता का परीक्षण करने और ऊतक पृथक्करण चरण की हैंडलिंग का परीक्षण करने का सुझाव देते हैं। विशेष रूप से, कोलेजेनेस पी इनक्यूबेशन की दीक्षा के बाद पहले 5 मिनट के आसपास, ऊतक के टुकड़ों को एक साथ इकट्ठा होना चाहिए। यह एक सामान्य स्थिति है। समुच्चय को 1 एमएल पिपेट का उपयोग करके हर 3-4 मिनट में विघटित किया जाता है, और बढ़ते समय के साथ, उन्हें मुश्किल से दिखाई देने तक छोटा हो जाना चाहिए।
इसके अलावा, यह एक सेल गिनती कक्ष में कोशिका गिनती करने के लिए centrifugation से पहले और पहले और फ़िल्टरिंग के बाद करने के लिए suboptimal supernatant हटाने के कारण संभावित सेल नुकसान का पता लगाने के लिए करने की सिफारिश की है। यदि अंतिम एकल-सेल निलंबन को शुद्ध करने की आवश्यकता है, तो FACS का उपयोग किया जा सकता है। सेल सॉर्टिंग न केवल मलबे या मृत कोशिकाओं को हटाने में सक्षम बनाता है, बल्कि महत्वपूर्ण रूप से फ्लोरोसेंटली लेबल वाले कोशिकाओं 13,19 के साथ अंतिम निलंबन को समृद्ध करने में सक्षम बनाता है। कतरनी तनाव या सेल सॉर्टर के क्लॉगिंग से बचने के लिए, एक विस्तृत नोजल (85 μm या 100 μm) का उपयोग किया जाता है। यह आगे क्रमबद्ध कोशिकाओं की व्यवहार्यता में सुधार होगा।
इस तकनीक को माउस और मानव दांतदोनों पर डिजाइन और परीक्षण किया गया था। प्रमुख सीमित कारक पुराने चूहों (दाढ़) और मनुष्यों के दांतों के कम दंत लुगदी में कोशिकाओं की छोटी संख्या है। मान लीजिए कि बड़ी संख्या में कोशिकाओं को प्राप्त करने की आवश्यकता है या पुराने रोगियों के दांतों से कोशिकाओं का अधिग्रहण किया जाना है। एक संभावित समाधान दांतों की एक उच्च संख्या को संसाधित करना और उन्हें एक एकल बैच में विलय करना है, जिसे बाद में एक नमूने के रूप में संसाधित किया जाता है।
मानव दंत लुगदी की जीवित कोशिकाओं को सबसे पहले बीस साल पहले कोलेजेनेस I और dispase23 के एंजाइम मिश्रण का उपयोग करके अलग किया गया था। तब से, दंत लुगदी कोशिकाओं के अलगाव का व्यापक रूप से उपयोग किया जाने लगा, और कई तकनीकों का उपयोग किया गया है5,6,7,8। यहां प्रस्तुत विधि का महत्वपूर्ण महत्व एससीआरएनए-सेक के लिए अंतिम सेल निलंबन की उच्च गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए अलगाव को तेज और कोमल बनाने के लिए सभी अलगाव चरणों का अनुकूलन है। उच्च कोशिका उपज एंजाइमों के साथ अधिक लंबे समय तक इनक्यूबेशन द्वारा प्राप्त की जा सकती है। यह प्रोटोकॉल एकल-सेल आरएनए-अनुक्रमण के लिए उपयुक्त गुणवत्ता के माउस और मानव दांतों से एकल कोशिकाओं को जल्दी से प्राप्त करने के लिए एक कुशल समाधान प्रदान करता है। इस तकनीक को केवल मामूली तकनीकी संशोधनों के साथ अन्य ऊतकों या जीवों के लिए व्यापक रूप से उपयोग किए जाने की उम्मीद है।
The authors have nothing to disclose.
जे.के. Masaryk University (MUNI / H / 1615/ 2018) की अनुदान एजेंसी द्वारा और जूनियर शोधकर्ता को चिकित्सा एमयू के संकाय से धन द्वारा समर्थित किया गया था। जेएल Masaryk University की अनुदान एजेंसी द्वारा समर्थित था, (MUNI / IGA / 1532/2020) और एक Brno पीएचडी प्रतिभा छात्रवृत्ति धारक है – Brno सिटी नगरपालिका द्वारा वित्त पोषित। टी.B ऑस्ट्रियाई विज्ञान कोष (Lise Meitner अनुदान: M2688-B28) द्वारा समर्थित था। हम मानव दांतों को प्राप्त करने में उनकी मदद के लिए लिडी इजाकोविचोवा होला और वेरोनिका कोवर माटेजोवा को धन्यवाद देते हैं। अंत में, हम RADEK Fedr और Karel Soucek FACS छँटाई के साथ अपनी तरह की सहायता के लिए धन्यवाद.
APC anti-mouse CD45 Antibody | BioLegend | 103112 | |
Bovine Serum Albumin Fraction V | Roche | 10735078001 | |
CellTrics 50 µm, sterile | Sysmex | 04-004-2327 | |
Collagenase P (COLLP-PRO) | Roche | 11213857001 | |
CUTFIX Scalpel Blades, Fig. 10 | AESCULAP | 16600495 | |
CUTFIX Scalpel Blades, Fig. 11 | AESCULAP | 16600509 | |
Fetal Bovine Serum (South America), Ultra low Endotoxin | Biosera | FB-1101/500 | |
Hank's balanced salt solution (HBSS) without Ca2+ and Mg2+ | SIGMA | H6648 | |
Industrial low lint wipes, MAX60 | Dirteeze | MAX60B176 | |
Industrial strong tweezers, style 660, bent serrated pointed tips, 150mm | Value-Tec | 50-014366 | |
Methyl alcohol A.G. | Penta | 21210-11000 | |
Propidium Iodide Solution | BioLegend | 421301 | |
Scalpel handle | CM Instrumente | AG-013-10 | |
Serological pipettes 10mL, individually wrapped, 200 pcs. | CAPP | SP-10-C | |
Stereo microscope | Leica | EZ4 | |
Surgical scissors (9cm) | CM Instrumente | AI-430-09Y | |
Tissue culture dish Ø 100 mm | TPP | 93100 |