Kryo-seksjon-disseksjon tillater fersk, frossen forberedelse av den største nevrogene nisjen i murinhjernen for dyp kvantitativ proteomanalyse. Metoden er presis, effektiv og forårsaker minimal vevsperturbasjon. Derfor er det ideelt egnet for å studere molekylær mikromiljø av denne nisjen, så vel som andre organer, regioner og arter.
Den subependymale nevrogene nisjen består av et paraventrikulært bånd av den laterale ventrikkelveggen til lateral ventrikelen. Den subependymale sonen (SEZ) er et tynt og tydelig område utsatt for ventriklene og cerebrospinalvæsken. Isolasjonen av denne nisjen tillater analyse av et nevrogent stamcellemikromiljø. Imidlertid er utvinning av små vev for proteomanalyse utfordrende, spesielt for vedlikehold av betydelig måledybde og oppnåelse av pålitelig robusthet. En ny metode kalt kryo-seksjon-disseksjon (CSD), som kombinerer høy presisjon med minimal vevsperturbasjon, ble utviklet for å løse disse utfordringene. Metoden er kompatibel med toppmoderne massespektrometri (MS) metoder som tillater påvisning av lav-rikelig nisjeregulatorer. Denne studien sammenlignet CSD og dens proteomdata med metoden og dataene som ble innhentet ved laserfangstmikrodisseksjon (LCM) og en standard fullmontert disseksjon. CSD-metoden resulterte i dobbelt kvantifiseringsdybde på mindre enn halvparten av tilberedningstiden sammenlignet med LCM og utkonkurrerte samtidig klart disseksjonspresisjonen til hele demonteringen. Derfor er CSD en overlegen metode for å samle SEZ for proteomanalyse.
Siden neurogenese er begrenset i den voksne hjernen, vil ulike reparasjonsstrategier i sentralnervesystemet ha stor nytte av økt forståelse av understøttelsene av voksen nevral erstatning. Gnagere har hjulpet oss med å forstå de grunnleggende mekanismene for postnatal neurogenese, selv om det bør bemerkes at voksen nevrogenese er sterkt artsavhengig. Hos mus er det tre voksne nevrale stamceller (NSC) nisjer. Hypothalamus er en voksen NSC nisje med nevrogent potensial1,2, mens kontinuerlig voksen neurogenese er hovedsakelig begrenset til hippocampus3 og SEZ av laterale vegger av laterale ventrikler4,5,6. SEZ er den største germinalregionen som inneholder NSC-er (type B-celler) som utvikler seg til nevroblaster (type A-celler) via transittforsterkningsceller (type C-celler). SEZ inneholder 20-35% av type B-celler, 1-15% av type C-celler, 1-30% av type A-celler og 25-50% av ependymale celler7. SEZ har en kompleks mikroarkitektur, med endotelceller, mikrogliale celler og ependymale celler som bor i og påvirker stamcellenisjen8,9,10. Selv om nevroner er knappe i SEZ, kommer axoner fra fjerne kilder som striatum, det ventrale tegmentalområdet, eller hypothalamus-rekkevidden og påvirker type B-celler4. Et unikt trekk ved denne stamcellenisjen er separasjonen mellom spredningsstedet og differensieringsstedet. Etter spredning migrerer de nevronale forfedrene flere millimeter fra SEZ til den olfaktoriske pæren, hvor de terminalt skiller seg ut i nevroner og integreres i eksisterende nevrale kretser. Undersøkelser av celleintrinsiske programmer knyttet til nevrogenese har allerede gitt kunnskap viktig for eksperimentell terapeutisk celle omprogrammering og transplantasjonsstrategier15,16,17,18,19,20. Imidlertid regulerer celleekstrinsiske signaler også nevrogenese, og vevsmiljøer kan bestemme den nevrogene skjebnen til stamceller11,12,14,21,22,23. Følgelig er undersøkelsen av mikromiljøet av de nevrogene nisjene og dens interaksjon med stamcellene av avgjørende betydning.
Den ekstracellulære matrisen (ECM) og andre utskilte proteiner er en stor del av mikromiljøet. For nøyaktig identifisering og kvantifisering er en proteomisk tilnærming bedre egnet enn en trans transcriptomisk tilnærming for å bestemme ECM-sammensetningen på grunn av den lave korrelasjonen mellom transkripsjon og proteinnivåer for ECM24,25. Videre er det betydelige bevis på at nisjeregulatorer i SEZ ikke utelukkende produseres av celler som fyller nisjen selv. Mer fjerne steder, som choroid plexus, utskiller modulatoriske signaler som overføres til stamcellene via cerebrospinalvæsken22,23. Å undersøke nisjeproteomet kan bidra til å identifisere nisjeregulatorer som er tilstede i nisjen uavhengig av produksjonsstedet, gitt at en betydelig del av det ekstracellulære mikromiljøet er samlet av proteiner.
For å samle murin ventrikkelsonen for objektiv proteomisk analyse, er det nødvendig med en metode med høy presisjon, og fanger ca. 50 μm tynt paraventrikulært bånd som inneholder stamceller mens du ekskluderer vevet til det tilstøtende striatum. Videre må vevsperturbasjon under avhandlingen minimaliseres for å analysere det ekstracellulære mikromiljøet fordi løselige proteiner, inkludert vekstfaktorer eller cytokiner, lett kan vaskes bort. Selv om det er mulig å analysere massespektraet av fast vev, vil det nødvendige middelet, for eksempel paraformaldehyd, redusere proteinidentifikasjonsdybden og kan introdusere posttranslasjonelle modifikasjoner. En vanlig helmontert SEZ-disseksjon, for eksempel for innsamling av celler for fluorescensaktivert cellesorteringsanalyse, fjerner hele SEZ med saks26. Denne standardavhandlingen er rask med minimal vevsperturbasjon. Striatal forurensning av prøvene kan imidlertid ikke unngås. På den annen side har LCM den enestående fordelen med overlegen disseksjonspresisjon. Imidlertid kan LCM introdusere vevsperturbasjoner, for eksempel på grunn av bakgrunnsfarging eller laser forårsaket protein denaturasjon. For å kombinere styrkene til hele disseksjonen og LCM ble det utviklet en ny metode som er kompatibel med MS, kalt kryo-seksjons-disseksjon (CSD), (figur 1A-D). CSD tillater utvinning av SEZ og disseksjonen av SEZ av medialveggene til laterale ventrikler (MEZ), som er et ideelt, for det meste ikke-nevrogen kontrollområde for SEZ (se protokollen). Nisjeproteomet oppnådd ved kombinasjonen av CSD og toppmoderne MS-metoder viste seg å være nyttig for karakterisering og identifisering av nye regulatorer i denne voksne NSC-nisjen25. Derfor vil denne metoden være nyttig for bestemmelse av SEZ vev proteinsammensetning.
CSD-metoden gjorde det mulig å nøyaktig trekke ut SEZ-vev og generere en pålitelig proteom med betydelig dybde ved hjelp av MS. CSD viser en klar fordel sammenlignet med full desinfeksjon når det gjelder sterkt redusert striatal forurensning av SEZ-prøver og ekstracellulær proteinberikelse. Siden det også er mulig å oppdage et lignende antall proteiner i individuelle prøver (~ 6500 proteiner per prøve) med CSD og full demontering, er tilleggstiden for CSD vel verdt innsatsen. LCM gir mer presis SEZ-disseksjon, men nådde en lavere proteomdybde, med bare 3500 proteiner per prøve til tross for at de brukte samme MS-protokoll som CSD (bibliotekmatching og etikettfri kvantifisering). Det er viktig at variasjonen var mye større, sannsynligvis på grunn av den åttedoble lengre tilberedningstiden per prøve. PCA av prøvene oppnådd av LCM og CSD avslører en klar separasjon av begge metodene med tette regionspesifikke klynger robust skilt fra hverandre. I motsetning viste LCM-prøvene en mer spredt distribusjon, noe som sannsynligvis delvis skyldes lengden på forberedelsen. Det er uklart om innsamling av langt flere prøver over en lengre periode ville gitt et proteom av lik robusthet og dybde med LCM. Beregning av et estimat, innsamling av et lignende prøvevolum som gjort for CSD ville ta 5-8 ganger lengre tid med LCM, selv opptil 15 ganger lenger hvis prøver gitt for peptidspektrabibliotekene ble inkludert, og mye av det under opptinte forhold. Videre, med tanke på de ekstra perturbasjonene av vevet som er nødvendig for LCM (bakgrunnsfarging, laser disseksjon), ga LCM lite, om noen, gevinst over CSD. Derfor kan CSD anses som mer egnet for ekstracellulær proteomforskning, spesielt for SEZ.
Spesielt hvis interesseområdet er mindre enn SEZ (f.eks. undersøker bare det ependymale cellelaget), faller en frihåndstilnærming bak nøyaktigheten til LCM. For eksempel er det vanskelig å bruke CSD til å skille det ependymale fra det subependymale laget, da det ependymale laget bare er en cellediameter bred, og avgrensningen mot det subependymale laget er ikke synlig for det blotte øye i ferskt frossent vev. Derfor vil LCM være et bedre valg enn CSD hvis en presis disseksjon på en skala under 50 μm er viktigere enn uforstyrret vev eller holder disseksjonstiden kort. For regioner med en bredde på 50 μm og mer er imidlertid presisjonen til CSD sammenlignbar med LCM for ECM proteinanalyse.
CSD har allerede vist seg å være nyttig ved å bidra til undersøkelsen av ECM’s funksjonelle rolle i den nevrogene nisje25. Derfor kan fortsatt anvendelse av CSD i SEZ for ulike protein- og proteomundersøkelser (eller til og med enkeltkjerne RNA-sekvensering) føre til deteksjon av ytterligere nevrogeneseregulatorer, stamcelleaktiveringsmarkører og en dypere forståelse av SEZ stamcelle nisjefysiologi. Tatt i betraktning nedgangen i nevrogenese i den aldrende SEZ37, kan en kortfattet analyse av ECM-endringer av SEZ av eldre vs. unge mus fremme forståelsen av de eksakte nisjemekanismene som fremmer NSC-utvikling og vedlikehold38,39. Videre er påvirkning av betennelse og skade på SEZ neurogenese godt etablert40,41,42,43. Berikelsen av blod-avledet fibrinogen i SEZ etter kortikale hjerneskade og dens innflytelse på SEZ astrogliogenese og arrdannelse44 fremhever den potensielle påvirkningen av traumeinduserte mikromiljøet endringer på SEZ stamcelle fysiologi. Derfor kan undersøkelse av SEZ-ECM-proteomet i forbindelse med hjerneskade ved hjelp av CSD bidra til å belyse mekanismene der skade og betennelse påvirker nevrogenese. Det er viktig at metoden også kan være aktuell for nevrogene nisjer i mennesker i helse og sykdom, da ferskt frossent vev ofte kan fås fra operasjoner. Videre, gitt artsforskjellene i voksen neurogenese, ville det også være fascinerende å bruke CSD-metoden på andre arter, for eksempel i forbindelse med striatal neurogenese. Videre, med andre proteindeteksjonsmetoder, kan forskjeller i lokalt produserte vekstfaktorer undersøkes nøyaktig og effektivt ved hjelp av CSD for SEZ og MEZ (f.eks. ELISA).
Til slutt kan disseksjonsprosedyren potensielt modifiseres for nøyaktig utvinning av andre hjerneregioner, også for forskningsspørsmål som ikke er relatert til nevrogenese. For eksempel inkluderer CSD et kort halvt tinende trinn, hvor kompakt myelin er synlig som hvite områder som skiller seg fra det mer gjennomskinnelige gjenværende hjernevevet. Med en enkel modifikasjon av metoden vil denne funksjonen tillate presis disseksjon av bare corpus callosum kompakt myelinvev, som kan bli utsatt for proteomisk analyse av skaderelaterte endringer. Et forslag om en protokollendring som vil tillate corpus callous disseksjon er å utelate trinn 1.5-1.9 av protokollen og fortsette direkte til å forberede koronal seksjoner i stedet for å åpne ventriklene for å gjøre SEZ og MEZ tilgjengelig. Plasser deretter seksjonene på tørris, løft kort og skru opp skivene halvveis, og fjern bare corpus callosum med en skalpell. Dette preparatet skal nå være klart for enhver analyse som krever en effektiv disseksjon av innfødt corpus callosum vev.
Oppsummert presenterer denne studien en mikro-disseksjonsmetode som kan brukes til pålitelig ventrikulær nevrogen nisjeproteomanalyse. Dataene understreker kompatibiliteten og nytten av CSD-metoden sammen med MS-basert proteomisk analyse av SEZ-mikromiljøet. Kombinasjonen av presisjon, effektivitet og minimal vevsperturbasjon gjør CSD til en verdifull forlengelse av eksisterende metoder.
The authors have nothing to disclose.
Vi ønsker oppriktig å takke Mathias Mann for at vi lot oss utføre store deler av eksperimentene i laboratoriet hans, Fabian Coscia for hjelp med LCM og proteomanalyse, Tatiana Simon-Ebert for hele disseksjoner, og Korbinian Mayr og Igor Paron for deres tekniske hjelp. Vi anerkjenner takknemlig finansiering fra det tyske forskningsrådet til MG (SFB870, TFR274), EU (Eranet S-700982-5008-001), ERC (aERC “NeuroCentro” til MG), Swedish Society for Medical Research (SSMF, to JK) postdoktorstipend, og KI foundations and Funds (2020-01351, til JK).
Cryostat CM3050S | Leica | ||
Dissecting microscope | Leica | ||
Dumont no. 5SF forceps, Inox super fine tip | Fine Science Tools | cat. no. 11252-00 | |
Hank’s Balanced Salt Solution with CaCl2 and MgCl2 | Invitrogen | cat. no. 24020 | |
HEPES buffer solution (1 M) | Invitrogen | cat. no. 15630 | |
Microscope slides | RS France | cat. no. BPB018 | |
Safe-lock tubes, PCR clean 2.0 mL | Eppendorf | cat. no. 0030123344 | |
Spring scissors, Vannas-Tubingen 5 mm | Fine Science Tools | cat. no. 15003-08 | |
Surgical disposable scalpels | B. Braun | cat. no. 5518083 | |
Tissue culture dishes 60 mm | Greiner Bio-One | cat. no. 633180 | |
Antibodies | |||
Alexa Fluor secondary antibodies (488, 555) (1/1,000) | ThermoFisher Scientific | cat. no. A-11001 | |
DAPI | Sigma | cat. no. D9542 | |
guinea pig polyclonal anti-DCX 1:500 | Millipore | cat. no. AB2253, | |
mouse monoclonal anti-GFAP 1:500 | Sigma | cat. no. G3893 | |
mouse monoclonal anti-MAG 1:400 | Millipore | cat. no. MAB1567 | |
Software | |||
GraphPad Prism version 9 | GraphPad Software, San Diego California USA | www.graphpad.com | |
Perseus Version 1.6.10.50 | Max-Planck Institute for Biochemistry, Munich Bavaria Germany | https://maxquant.net/perseus/ | |
ZEN imaging software | Carl Zeiss |