骨格筋ミトコンドリアのタンパク質輸入能の測定
Summary
ミトコンドリアは、骨格筋の表皮形成性の高いレベルを示す重要な代謝小器官です。細胞質ゾルからのタンパク質のインポートは、レチクルムの拡張とミトコンドリア機能の維持に不可欠なオルガネラ生物形成のための重要な経路です。 したがって、タンパク質のインポートは、細胞の健康のバロメーターとして機能します。
Abstract
ミトコンドリアは、細胞の全体的な健康と同様にエネルギー供給を決定する主要な代謝および調節オルガネラである。骨格筋では、ミトコンドリアは、小さな楕円形のオルガネラから広いレチクルムのようなネットワークに至るまで、一連の複雑な形態に存在する。 ミトコンドリアレチクルムがエネルギー需要の変化などの多様な刺激に対応してどのように拡大し発展するかを理解することは、長い間研究のトピックとなっています。 この成長の重要な側面、または生物形成は、核ゲノムによって元々コードされた前駆体タンパク質の輸入であり、サイトゾルで合成され、様々なミトコンドリアサブコンパートメントに転位する。ミトコンドリアは、タンパク質輸入機械(PIM)として知られている多くの選択的な内膜および外膜チャネルを含む、この輸入プロセスのための洗練されたメカニズムを開発しました。ミトコンドリアへの輸入は、酸化リン酸化による生存可能な膜電位およびオルガネラ由来ATPの利用可能性に依存する。したがって、その測定はオルガネラの健康の尺度として役立ちます。PIMはまた細胞のエネルギー状態に密接に結合される骨格筋の適応可塑性の高レベルを示す。 例えば, 運動訓練は、輸入能力を高めるために示されています, 筋肉の使用が減少しながら, ミトコンドリアの含有量のマーカーの変化と一致.タンパク質のインポートは、ミトコンドリアの生物形成と拡張の重要なステップであるが、このプロセスは骨格筋で広く研究されていません。 本稿では、骨格筋から孤立した完全機能ミトコンドリアを使用してタンパク質の輸入能力を測定し、運動、健康、疾患におけるオルガネラターンオーバー経路の重要性をより深く理解する方法を概説する。
Introduction
ミトコンドリアは、異なる細胞型の複雑な形態に存在するオルガネラであり、細胞の健康に不可欠な機能の増加配列を有すると認識されている。したがって、彼らはもはやエネルギーを生み出すオルガネラに打ちのめすることはできません。ミトコンドリアは、主要な代謝調節因子であり、細胞運命の決定因子であり、シグナルハブであり、その機能は全体的な細胞の健康の有用な指標として役立つ可能性がある。骨格筋細胞では、電子顕微鏡検査研究は、地理的に異なる皮質下(SS)およびミトコンドリア間(IMF)ミトコンドリアの存在を明らかにし、現在は非常にダイナミックで、骨格筋活動レベルの変化に適応可能であると認識されている。ミトコンドリアの筋肉の含有量および機能は、多くの方法で評価することができます5,6、および細胞milieu7,8の影響とは異なるミトコンドリアの呼吸および酵素能力(Vmax)をよりよく理解するためにオルガネラ分離の伝統的な方法が適用されています。特に、これらの伝統的な方法は、サブサルコレム領域とミノフィブリラー領域から単離されたミトコンドリアの微妙な生化学的区別を明らかにし、これらの細胞下領域における代謝に対する機能的な影響の可能性を示唆している8,9,10,11。
ミトコンドリアの生物形成は、核およびミトコンドリアDNAの両方からの遺伝子産物の寄与を必要とする唯一の特徴である。しかし、mtDNAの転写は13個のタンパク質の合成につながるだけなので、これらの大部分は核に由来しています。ミトコンドリアは通常、多様な代謝経路に関与する>1000タンパク質を含むため、オルガネラの生物形成は、適切な化学測定および機能を維持するために、細胞質ゾルから様々なミトコンドリアサブコンパートメントへの前駆体タンパク質の輸入および組み立ての厳重に調節された手段を必要とする12,13。ミトコンドリアに向かう核コード化タンパク質は、通常、ミトコンドリアターゲティング配列(MTS)を運び、それらを標的とし、そのサブ区画局在化を促進する。ほとんどのマトリックス結合タンパク質はクレアブルN末端MTSを含み、外側または内側のミトコンドリア膜に向かうタンパク質は通常、内部標的ドメイン14を有する。インポートプロセスは、オルガネル13に入るための複数の道を提供する多様なチャネルのセットによって行われます。外膜(TOM)のトランスロケースは、細胞質ゾルから膜間空間に前駆体をシャトルし、そこで内膜(TIM)複合体のトランスロケースによって認識される。この複合体は、核コード化された前駆体をマトリックスにインポートし、プロテアーゼがN末端ターゲティング前配列を切断する役割を担う。外膜に向かうタンパク質は、TOM複合体を介してこの膜に直接挿入することができ、内膜に向かうタンパク質はTIMタンパク質、特にTIM22によって挿入される。タンパク質は、インポート後に、共存プロテアーゼとシャペロンによってさらに処理され、しばしば結合して電子輸送鎖に見られるようなより大きな複合体を形成します。
ミトコンドリアタンパク質のインポート自体は、このプロセスは、膜電位とATP15の形でエネルギー源の存在に依存しているので、ミトコンドリアの健康の測定としても機能します。例えば、膜電位が消滅すると、プロテインキナーゼPINK1はオルガネラによって取り込むことができず、これはmitophagy16,17と呼ばれる経路を介して小器官の分解の発症を引き起こすリン酸化シグナルにつながります。同様の状況下では、インポートが妨げられると、タンパク質ATF5はオルガネラに入ることができず、その後核に移り変え、UPR遺伝子発現のアップレギュレーションの転写因子として機能します18,19。したがって、タンパク質のインポート効率を測定することで、オルガネラの健康に関する包括的な洞察を提供することができ、一方、遺伝子発現応答は、核への逆行シグナル伝達の程度を示すために使用することができる。
ミトコンドリアの生物形成と一般的な細胞の健康にとって明らかな重要性にもかかわらず、哺乳類ミトコンドリアの輸入経路は著しく研究されている。本報告では、骨格筋ミトコンドリアへの前駆体タンパク質のインポート測定に関わる具体的なステップを説明し、筋肉や使用の変化に対する輸入系の適応応答を示すデータを提供し、骨格筋の適応可塑性に対するタンパク質のインポートの寄与を示す。
Protocol
Representative Results
Discussion
ミトコンドリアは、核ゲノムとミトコンドリアゲノムの両方の発現と協調性に依存し、細胞内での合成と拡張に対して独自に依存しています。しかし、核ゲノムはミトコンドリアプロテオームの大部分(99%)をコードしており、ミトコンドリア生物新生をサポートするタンパク質輸入機械の重要性を強調しています。インポートは、インポートの失敗が展開されたタンパク質応答および/またはm…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、マギル大学のG.Cショア博士、ワシントン医学部のA.シュトラウス博士、ラ・トローブ大学の.M T.ライアン博士に対し、この研究に使用された発現プラスミドの当初の寄付に感謝したいと考えています。この研究は、カナダ自然科学工学研究評議会(NSERC)からD.A.フッドへの資金提供によって支えられた。D. A. フッドは、細胞生理学のカナダ研究委員長の保有者でもあります。
Materials
| 0.2% BSA | Sigma | A2153 | |
| 35S-methionine | Perkin Elmer | NEG709A500UC | Purchase requires a valid radioisotope permit |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| Blotting paper; Whatman 3MM CHR Paper | Thermo Fisher | 05-714-5 | |
| Cassette for film | Kodak | Kodak Xomatic | |
| Centrifugation Tube | Thermo Fisher | 3138-0050 | |
| Chloroform | Thermo Fisher | C298-4 | |
| DTT | Sigma | D9779-5G | |
| EDTA | BioShop | EDT002 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Gel Dryer | BioRad | Model 583 | |
| Gel Drying Kit | Sigma or BioRad | Z377570-1PAK or OW-GDF-10 | Various options are commercially available through many companies, these are just as few examples. |
| Glycerol | Caledon Laboratory Chemicals | 5350-1-40 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 Centrifuge | |
| Homogenizer | IKA | T25 Digital Ultra Turrex | |
| Isoamylalcohol, or 3-methylbutanol | Sigma | I9392 | |
| KAc | BioShop | POA301.500 | |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| M7G | New England Biolab | S1404S | Dilute with 1000ul 20mM HEPES to make 1mM stock |
| MgCl | BioShop | MAG510 | |
| MgSO4 | Thermo Fisher | M65-500 | |
| MOPS | BioShop | MOP001 | |
| NaCl | BioShop | SOD001 | |
| NTP | Thermo Fisher | R0191 | |
| OCT Plasmid | – | – | Donated from Dr. G. C. Shore, McGill University, Montreal, Canada; alternative available through Addgene, plasmid #71877 |
| pGEM4Z/hTom40 Plasmid | – | – | Donated from Dr. M. T. Ryan, La Trobe University, Melbourne, Australia |
| pGMDH Plasmid | – | – | Donated from Dr. A. Strauss, Washington University School of Medicine |
| Phenol | Sigma | P4557 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyalcohol | Sigma | P3803 | Can also be made with the ratio provided |
| Phosphorus Film | Fujifilm | BAS-IP MS 2025 | |
| Rabbit reticulocyte lysate | Promega | L4960 | Avoid freeze-thaw; aliquot lysate upon arrival; amino acids are provided in the kit as well |
| RNAsin | Promega | N2311 | |
| Rotor for High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | JA-25.50 | |
| SDS | BioShop | SDS001.500 | Caution: harmful if ingested or inhaled, wear a mask. |
| Sodium acetate | Bioshop | SAA 304 | |
| Sodium Carbonate | VWR | BDH9284 | |
| Sodium salicylate | Millipore Sigma | 106601 | |
| Sorbitol | Sigma | S6021 | |
| SP6 RNA Polymerase | Promega | P1085 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher | Nanodrop 2000 | |
| Spermidine | Sigma | S-2626 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| T7 RNA Polymerase | Promega | P2075 | |
| Tabletop Centrifuge | Thermo Fisher | AccuSpin Micro 17 | |
| Trichloroacetic acid | Thermo Fisher | A322-500 | |
| Tris | BioShop | TRS001 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250-100ML |
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