Misurazione della capacità di importazione di proteine dei mitocondri del muscolo scheletrico
Summary
I mitocondri sono organelli metabolici chiave che mostrano un alto livello di plasticità fenotipica nel muscolo scheletrico. L’importazione di proteine dal citosol è una via critica per la biogenesi degli organelli, essenziale per l’espansione del reticolo e il mantenimento della funzione mitocondriale. Pertanto, l’importazione di proteine funge da barometro della salute cellulare.
Abstract
I mitocondri sono organelli metabolici e regolatori chiave che determinano l’approvvigionamento energetico e la salute generale della cellula. Nel muscolo scheletrico, i mitocondri esistono in una serie di morfologie complesse, che vanno da piccoli organelli ovali a un’ampia rete simile al reticolo. Capire come il reticolo mitocondriale si espande e si sviluppa in risposta a diversi stimoli come le alterazioni della domanda di energia è stato a lungo un argomento di ricerca. Un aspetto chiave di questa crescita, o biogenesi, è l’importazione di proteine precursori, originariamente codificate dal genoma nucleare, sintetizzate nel citosol e traslocate in vari sottocomparti mitocondriali. I mitocondri hanno sviluppato un meccanismo sofisticato per questo processo di importazione, che coinvolge molti canali selettivi della membrana interna ed esterna, noti come meccanismo di importazione delle proteine (PIM). L’importazione nel mitocondrio dipende dal potenziale di membrana vitale e dalla disponibilità di ATP derivato dagli organelli attraverso la fosforilazione ossidativa. Pertanto la sua misurazione può servire come misura della salute degli organelli. Il PIM mostra anche un alto livello di plasticità adattiva nel muscolo scheletrico che è strettamente accoppiato allo stato energetico della cellula. Ad esempio, l’allenamento fisico ha dimostrato di aumentare la capacità di importazione, mentre il disuso muscolare lo riduce, in coincidenza con i cambiamenti nei marcatori del contenuto mitocondriale. Sebbene l’importazione di proteine sia un passo fondamentale nella biogenesi e nell’espansione dei mitocondri, il processo non è ampiamente studiato nel muscolo scheletrico. Pertanto, questo documento delinea come utilizzare mitocondri isolati e completamente funzionali dal muscolo scheletrico per misurare la capacità di importazione di proteine al fine di promuovere una maggiore comprensione dei metodi coinvolti e un apprezzamento dell’importanza del percorso per il turnover degli organelli nell’esercizio fisico, nella salute e nella malattia.
Introduction
I mitocondri sono organelli che esistono in morfologie complesse in diversi tipi di cellule e sono riconosciuti per possedere una gamma crescente di funzioni che sono fondamentali per la salute cellulare. In quanto tali, non possono più essere ridotti semplicemente agli organelli che producono energia. I mitocondri sono regolatori metabolici chiave, determinanti del destino cellulare e hub di segnalazione, le cui funzioni possono servire come utili indicatori della salute cellulare generale. Nelle cellule muscolari scheletriche, gli studi di microscopia elettronica rivelano la presenza di mitocondri subsarcolemmali (SS) e intermiofibrillari (IMF) geograficamente distinti, che mostrano un grado di connettività1,2,3,4 che è ora riconosciuto come altamente dinamico e adattabile ai cambiamenti nei livelli di attività muscolare scheletrica, nonché con l’età e la malattia. Il contenuto e la funzione mitocondriale nel muscolo possono essere valutati in numerosi modi5,6 e sono stati applicati metodi tradizionali di isolamento degli organelli per comprendere meglio le capacità respiratorie ed enzimatiche (Vmax) dei mitocondri distinte dall’influenza dell’ambiente cellulare7,8. In particolare, questi metodi tradizionali hanno rivelato sottili distinzioni biochimiche tra mitocondri isolati dalle regioni subsarcolemmali e intermiofibrillari, smentendo possibili implicazioni funzionali per il metabolismo in queste regioni subcellulari8,9,10,11.
La biogenesi dei mitocondri è unica nel richiedere il contributo di prodotti genici sia dal DNA nucleare che da quello mitocondriale. Tuttavia, la stragrande maggioranza di questi sono derivati dal nucleo poiché la trascrizione del mtDNA porta solo alla sintesi di 13 proteine. Poiché i mitocondri comprendono normalmente proteine >1000 coinvolte in diverse vie metaboliche, la biogenesi dell’organello richiede un mezzo strettamente regolato di importazione e assemblaggio di proteine precursori dal citosol nei vari sottocompartimenti mitocondriali per mantenere una corretta stechiometria e funzione12,13. Le proteine codificate nucleare destinate ai mitocondri normalmente trasportano una sequenza di targeting mitocondriale (MTS) che le indirizza all’organello e facilita la loro localizzazione sub-compartimentale. La maggior parte delle proteine legate alla matrice contengono un MTS N-terminale scissibile, mentre quelle destinate alla membrana mitocondriale esterna o interna di solito hanno domini di targeting interni14. Il processo di importazione viene effettuato da una serie di canali diversi che forniscono più strade per l’ingresso nell’organello13. Il complesso translocase della membrana esterna (TOM) trasporta i precursori dal citosol nello spazio intermembrana, dove sono riconosciuti dal translocase del complesso della membrana interna (TIM). Questo complesso è responsabile dell’importazione di precursori codificati nucleari nella matrice, dove le proteasi scisdono la presequenza di targeting N-terminale. Le proteine destinate alla membrana esterna possono essere inserite direttamente in questa membrana attraverso il complesso TOM, mentre quelle destinate alla membrana interna sono inserite da una proteina TIM, nello specifico TIM22. Dopo la loro importazione, le proteine vengono ulteriormente elaborate da proteasi e chaperoni residenti e spesso si combinano per formare complessi più grandi, come quelli che si trovano nella catena di trasporto degli elettroni.
L’importazione stessa di proteine mitocondriali serve anche come misura della salute mitocondriale, poiché questo processo si basa sulla presenza di potenziale di membrana e una fonte di energia sotto forma di ATP15. Ad esempio, quando il potenziale di membrana viene dissipato, la proteina chinasi PINK1 non può essere assorbita dall’organello, e questo porta a segnali di fosforilazione che innescano l’insorgenza della degradazione dell’organello attraverso una via chiamata mitofagia16,17. In circostanze analoghe, quando l’importazione è ostacolata, la proteina ATF5 non può entrare nell’organello e successivamente trasloca nel nucleo, dove funge da fattore di trascrizione per l’up-regolazione dell’espressione genica UPR18,19. Pertanto, la misurazione dell’efficienza dell’importazione di proteine può fornire una visione completa della salute dell’organello, mentre la risposta all’espressione genica può essere utilizzata per indicare il grado di segnalazione retrograda al nucleo.
Nonostante la sua ovvia importanza per la biogenesi dei mitocondri e per la salute cellulare in generale, la via di importazione nei mitocondri dei mammiferi è notevolmente poco studiata. In questo rapporto, descriviamo i passaggi specifici coinvolti nella misurazione dell’importazione di proteine precursori nei mitocondri del muscolo scheletrico e forniamo dati per illustrare la risposta adattativa del sistema di importazione ai cambiamenti muscolari e al disuso, illustrando il contributo dell’importazione proteica alla plasticità adattativa del muscolo scheletrico.
Protocol
Representative Results
Discussion
I mitocondri dipendono in modo univoco dall’espressione e dal coordinamento dei genomi nucleari e mitocondriali per la loro sintesi ed espansione all’interno delle cellule. Tuttavia, il genoma nucleare codifica la stragrande maggioranza (99%) del proteoma mitocondriale, e questo sottolinea l’importanza del meccanismo di importazione delle proteine nel sostenere la biogenesi mitocondriale. L’importazione funge anche da importante evento di segnalazione, poiché la mancata importazione può promuovere l’inizio della rispos…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare il Dr. G.C. Shore della McGill University, il Dr. A. Strauss della Washington School of Medicine e il Dr.M.T. Ryan della La Trobe University per le donazioni originali di plasmidi di espressione che sono stati utilizzati per questa ricerca. Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti del Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) a D. A. Hood. D. A. Hood è anche titolare di una cattedra di ricerca canadese in fisiologia cellulare.
Materials
| 0.2% BSA | Sigma | A2153 | |
| 35S-methionine | Perkin Elmer | NEG709A500UC | Purchase requires a valid radioisotope permit |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| Blotting paper; Whatman 3MM CHR Paper | Thermo Fisher | 05-714-5 | |
| Cassette for film | Kodak | Kodak Xomatic | |
| Centrifugation Tube | Thermo Fisher | 3138-0050 | |
| Chloroform | Thermo Fisher | C298-4 | |
| DTT | Sigma | D9779-5G | |
| EDTA | BioShop | EDT002 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Gel Dryer | BioRad | Model 583 | |
| Gel Drying Kit | Sigma or BioRad | Z377570-1PAK or OW-GDF-10 | Various options are commercially available through many companies, these are just as few examples. |
| Glycerol | Caledon Laboratory Chemicals | 5350-1-40 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 Centrifuge | |
| Homogenizer | IKA | T25 Digital Ultra Turrex | |
| Isoamylalcohol, or 3-methylbutanol | Sigma | I9392 | |
| KAc | BioShop | POA301.500 | |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| M7G | New England Biolab | S1404S | Dilute with 1000ul 20mM HEPES to make 1mM stock |
| MgCl | BioShop | MAG510 | |
| MgSO4 | Thermo Fisher | M65-500 | |
| MOPS | BioShop | MOP001 | |
| NaCl | BioShop | SOD001 | |
| NTP | Thermo Fisher | R0191 | |
| OCT Plasmid | – | – | Donated from Dr. G. C. Shore, McGill University, Montreal, Canada; alternative available through Addgene, plasmid #71877 |
| pGEM4Z/hTom40 Plasmid | – | – | Donated from Dr. M. T. Ryan, La Trobe University, Melbourne, Australia |
| pGMDH Plasmid | – | – | Donated from Dr. A. Strauss, Washington University School of Medicine |
| Phenol | Sigma | P4557 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyalcohol | Sigma | P3803 | Can also be made with the ratio provided |
| Phosphorus Film | Fujifilm | BAS-IP MS 2025 | |
| Rabbit reticulocyte lysate | Promega | L4960 | Avoid freeze-thaw; aliquot lysate upon arrival; amino acids are provided in the kit as well |
| RNAsin | Promega | N2311 | |
| Rotor for High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | JA-25.50 | |
| SDS | BioShop | SDS001.500 | Caution: harmful if ingested or inhaled, wear a mask. |
| Sodium acetate | Bioshop | SAA 304 | |
| Sodium Carbonate | VWR | BDH9284 | |
| Sodium salicylate | Millipore Sigma | 106601 | |
| Sorbitol | Sigma | S6021 | |
| SP6 RNA Polymerase | Promega | P1085 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher | Nanodrop 2000 | |
| Spermidine | Sigma | S-2626 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| T7 RNA Polymerase | Promega | P2075 | |
| Tabletop Centrifuge | Thermo Fisher | AccuSpin Micro 17 | |
| Trichloroacetic acid | Thermo Fisher | A322-500 | |
| Tris | BioShop | TRS001 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250-100ML |
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