Summary

माउस कार्डियोमायोसाइट्स को लगातार अलग करने के लिए एक सरल और प्रभावी तरीका

Published: November 11, 2022
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Summary

सेलुलर और आणविक कार्यात्मक प्रयोगों के लिए कार्डियोलॉजी में स्वर्ण मानक कार्डियोमायोसाइट्स हैं। यह लेख माउस कार्डियोमायोसाइट्स को अलग करने के लिए गैर-लैंगनडॉर्फ तकनीक के अनुकूलन का वर्णन करता है।

Abstract

कार्डियक जीव विज्ञान में अनुसंधान के लिए उच्च गुणवत्ता वाले कार्डियोमायोसाइट्स उत्पन्न करने वाले प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य लेकिन तकनीकी रूप से सरल तरीकों की आवश्यकता आवश्यक है। कार्डियोमायोसाइट्स पर सेलुलर और आणविक कार्यात्मक प्रयोग (जैसे, संकुचन, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, कैल्शियम साइकिलिंग, आदि) रोग के तंत्र (ओं) की स्थापना के लिए स्वर्ण मानक हैं। माउस कार्यात्मक प्रयोगों के लिए पसंद की प्रजाति है और वर्णित तकनीक विशेष रूप से माउस कार्डियोमायोसाइट्स के अलगाव के लिए है। लैंगनडॉर्फ तंत्र की आवश्यकता वाले पिछले तरीकों को महाधमनी प्रवेशनी के लिए उच्च स्तर के प्रशिक्षण और परिशुद्धता की आवश्यकता होती है, जिसके परिणामस्वरूप अक्सर इस्केमिया होता है। यह क्षेत्र लैंगनडॉर्फ-मुक्त अलगाव विधियों की ओर बढ़ रहा है जो सरल हैं, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं, और शारीरिक डेटा अधिग्रहण और संस्कृति के लिए व्यवहार्य मायोसाइट्स उत्पन्न करते हैं। ये विधियां महाधमनी प्रवेशनी की तुलना में इस्केमिया के समय को बहुत कम कर देती हैं और इसके परिणामस्वरूप मज़बूती से प्राप्त कार्डियोमायोसाइट्स होते हैं। लैंगनडॉर्फ-मुक्त विधि के हमारे अनुकूलन में बर्फ-ठंडा समाशोधन समाधान के साथ एक प्रारंभिक छिड़काव शामिल है, एक स्थिर मंच का उपयोग जो छिड़काव के दौरान एक स्थिर सुई सुनिश्चित करता है, और कार्यात्मक माप और संस्कृति में उपयोग के लिए विश्वसनीय रूप से प्राप्त कार्डियोमायोसाइट्स सुनिश्चित करने के लिए अतिरिक्त पाचन कदम। यह विधि सरल और प्रदर्शन करने के लिए त्वरित है और इसके लिए थोड़ा तकनीकी कौशल की आवश्यकता होती है।

Introduction

दशकों से, कार्डियक जीवविज्ञान साहित्य में एक आवश्यक विचार कार्रवाई का आणविक तंत्र है। विश्वसनीय अध्ययन प्रकाशित करने के लिए कार्रवाई का तंत्र स्थापित किया जाना चाहिए। आणविक तंत्र को निर्धारित करने के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित रणनीति पृथक कार्डियोमायोसाइट्स अध्ययन है, जिसे भरोसेमंद डेटा प्राप्त करने के लिए उच्च गुणवत्ता वाले कार्डियोमायोसाइट्स की आवश्यकता होती है। कार्रवाई के तंत्र को निर्धारित करने के लिए कार्डियोमायोसाइट्स पर किए गए सेलुलर और आणविक प्रयोग संकुचनकी जांच के लिए स्वर्ण मानक हैं 1, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी2, कैल्शियम (सीए2 +) साइकिल चलाना3, मायोफिलामेंट सीए2 + संवेदनशीलता4, साइटोस्केलेटन5, चयापचय6, हार्मोन7 के प्रभाव, सिग्नलिंग अणु8, दवा अध्ययन9 आदि। माउस आनुवंशिक हेरफेर, इसके छोटे आकार, इसके अपेक्षाकृत कम जीवनकाल, कम लागत आदि की आसानी के कारण अधिकांश कार्डियक जीव विज्ञान प्रयोगों के लिए पसंद की प्रजाति बन गयाहै। हालांकि, उच्च गुणवत्ता वाले माउस कार्डियोमायोसाइट्स का विश्वसनीय अलगाव वर्तमान तकनीकों के साथ तुच्छ नहीं है।

प्रयोगशालाएं लगभग 70 वर्षों से कार्डियोमायोसाइट्स को अलग कर रहीहैं। कार्डियोमायोसाइट्स को अलग करने के लिए लगभग सभी तकनीकें विभिन्न एंजाइमों (कोलेजनेज, प्रोटीज, ट्रिप्सिन, आदि) के माध्यम से हृदय के पाचन पर निर्भर करती हैं। शुरुआती अवधि (1950-1960 के दशक) में, चंक विधि का उपयोग किया गया था, जिसमें हृदय को हटाना, बहुत छोटे टुकड़ों में काटना और कोलेजनेज / प्रोटीज / ट्रिप्सिन12 के साथ समाधान में इनक्यूबेट करना शामिल था। 1970 के दशक में प्रयोगशालाओं ने “लैंगेंडॉर्फ” विधि13 को लागू किया, जिसने कोरोनरी धमनी छिड़काव-आधारित अलगाव तकनीक (लैंगेंडोर्फ तंत्र के माध्यम से एंजाइम के साथ प्रतिगामी छिड़काव) का उपयोग करके कार्डियोमायोसाइट्स को अलग किया; यह तकनीक आज भी क्षेत्र में मायोसाइट अलगाव की प्रमुख विधि बनी हुई है, ~ 50 साल बाद 14,15,16। हाल के काम ने हाइपोक्सिया समय और इस्केमिक क्षति को सीमित करने के लिए विवो में दिल को पतला करने के लिए स्थानांतरित कर दिया है जिसके परिणामस्वरूप बेहतर कार्डियोमायोसाइट अलगाव (बेहतर पैदावार और उच्च गुणवत्ता) 17 है। हाल ही में, यह विवो, लैंगनडॉर्फ-मुक्त हृदय छिड़काव 18,19,20,21,22 में प्रदर्शन में विकसित हुआ है। हमने एकर्स-जॉनसन एट अल.18 तकनीक के आधार पर लैंगेंडॉर्फ-मुक्त कार्डियोमायोसाइट्स अलगाव तकनीक विकसित की है और कई पिछली अलगाव तकनीकों से विभिन्न घटकों को अनुकूलित किया है। इन प्रमुख अनुकूलनों में एक बर्फ-ठंडा समाशोधन बफर का इंजेक्शन और सुई को स्थिर करने के लिए एक सहायक मंच का समावेश शामिल है, जिससे हृदय के हेरफेर में कमी आई है। इस तकनीक में इंजेक्शन बफर (37 डिग्री सेल्सियस) का तापमान नियंत्रण भी विस्तृत है, जिसने पहले प्रकाशित 18 के रूप में कम ईडीटीए छिड़काव के कारण विवो इंजेक्शन और पाचन के बीच के समय को कमकर दिया। हृदय के हेरफेर को कम करके और इसलिए पंचर साइट के आकार को कम करके, कोरोनरी धमनियों का संपूर्ण और निरंतर छिड़काव प्राप्त किया जाता है। हमने तकनीक को द्वितीयक खंड विधि पाचन के साथ भी परिष्कृत किया, इंजेक्शन क्लियरिंग बफर में ईडीटीए की मात्रा, और पीएच को बदल दिया। हमारी वर्णित तकनीक अधिक विश्वसनीय, अधिक कुशल है, और लैंगेंडॉर्फ तंत्र (तालिका 1) का उपयोग करने की तुलना में व्यापक प्रशिक्षण / अभ्यास की आवश्यकता नहीं है।

Protocol

इस अध्ययन में की गई सभी प्रक्रियाओं को एनआईएच दिशानिर्देशों के अनुसार ओहियो स्टेट यूनिवर्सिटी में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। 1. समाधान तैयार करना<…

Representative Results

अलगाव की सफलता का निर्धारण करते समय जांच करने के लिए कुछ तत्व हैं। सबसे पहले, कार्डियोमायोसाइट्स को रॉड के आकार का होना चाहिए, जिसमें कोई झिल्ली ब्लीब्स नहीं होना चाहिए, जैसे कि चित्रा 1 में अ…

Discussion

हमारे लैंगनडॉर्फ-मुक्त कार्डियोमायोसाइट्स अलगाव तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह लैंगेंडॉर्फ तंत्र में प्रवेशनी की आवश्यकता नहीं करके हाइपोक्सिया और इस्केमिक समय को सीमित करता है। वैकल्पिक रूप से शा?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ ग्रांट्स आर01 एचएल114940 (बिसियाडेकी), आर01 एजी060542 (जिओलो), और टी32 एचएल134616 (स्टरगिल और सालियर) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

10 cc Bd Luer-Lok Syringe Fisher Sci 14-827-52
10 mL Pyrex Low-Form Beaker Cole-Palmer UX-34502-01
100 mL polypropylene cap glass media storage bottle DWK Life Sciences UX-34523-00
14 mL Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap Fisher Sci 14-959-11B
2,3-Butanedione Monoxime Sigma B0753 >98%
3 cc BD Luer-Lok Syringe Fisher Sci 14-823-435
35 mm glass bottom dishes MatTek Corporation P35G-1.0-20-C
50 mL BD Syringe without Needle Fisher Sci 13-689-8
50 mL Conical Centrifuge Tubes Cole-Palmer EW-22999-84
95% O2 5% CO2
AIMS Space Gel Heating Pad Fisher Sci 14-370-223
BD PrecisionGlide 27 G X 1/2" Hypodermic Needles Becton Dickinson 305109
Bovine Serum Albumin Sigma A3803 Heat shock fraction, lyophilized powder, essentially fatty acid free, >98%
Calcium Chloride dihydrate Sigma C7902 >99%
D-(+)-Glucose Sigma G7021 Suitable for cell culture, >99.5%
DMEM Fisher Sci 11965092
EDTA Fisher Sci AAA1071336
Falcon 100 mm TC-treated Cell Culture Dish Corning 353003
FBS R&D Systems (Bio-techne) S11195
Fisherbrand Isotemp Heated Immersion Circulators Fisher Sci 13-874-432
Hartman Mosquito Hemostatic Forceps World Precision Instruments 15921
Hausser Scientific Hy-Lite Counting Chamber Set Fisher Sci 02-671-11
HEPES Sigma H4034 >99.5%
Labeling Tape Fisher Sci 15-901-10R
Legato 100 Syringe Pump kdScientific 788100
L-glutathione Fisher Sci ICN19467980
Liberase TH Research Grade Sigma 5401135001 High thermolysin concentration
M199 Fisher Sci MT10060CV
Magnesium Chloride Invitrogen AM9530G
Mouse Laminin Corning 354232
Pen/Strep Fisher Sci
Potassium Chloride Sigma P5405 >99%
Precision Digital Reciprocating Water Bath ThermoFisher Scientific TSCIR19
Sodium Bicarbonate Sigma S5761 Suitable for cell culture
Sodium Chloride Sigma S5886 >99%
Sodium phosphate monobasic Sigma S5011 >99%
Sterile Cell Strainer 70 µm Fisher Sci 22-363-548
Student Fine Scissors Fine Science Tools 91460-11
VWR Absorbent Underpads Fisher Sci NC9481815

References

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Sturgill, S. L., Salyer, L. G., Biesiadecki, B. J., Ziolo, M. T. A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (189), e63056, doi:10.3791/63056 (2022).

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