마우스 심근 세포를 일관되게 분리하는 간단하고 효과적인 방법
Summary
세포 및 분자 기능 실험을 위한 심장학의 황금 표준은 심근 세포입니다. 이 기사에서는 마우스 심근 세포를 분리하기 위한 비 Langendorff 기술에 대한 적응에 대해 설명합니다.
Abstract
고품질 심근 세포를 생성하는 재현 가능하면서도 기술적으로 간단한 방법의 필요성은 심장 생물학 연구에 필수적입니다. 심근 세포에 대한 세포 및 분자 기능 실험(예: 수축, 전기생리학, 칼슘 순환 등)은 질병의 메커니즘을 확립하기 위한 황금 표준입니다. 마우스는 기능 실험을 위해 선택되는 종이며 설명된 기술은 특히 마우스 심근 세포의 분리를 위한 것입니다. Langendorff 장치가 필요한 이전 방법은 대동맥 캐뉼라 삽입을 위해 높은 수준의 훈련과 정밀도가 필요하며 종종 허혈을 초래합니다. 이 분야는 단순하고 재현 가능하며 생리학적 데이터 수집 및 배양을 위한 생존 가능한 근세포를 생성하는 Langendorff-free 분리 방법으로 이동하고 있습니다. 이러한 방법은 대동맥 캐뉼라 삽입에 비해 허혈 시간을 크게 줄이고 안정적으로 얻은 심근 세포를 생성합니다. Langendorff-free 분석법에 대한 당사의 적응에는 얼음처럼 차가운 투명 용액을 사용한 초기 관류, 관류 중 안정적인 바늘을 보장하는 안정화 플랫폼 사용, 기능 측정 및 배양에 사용하기 위해 안정적으로 얻은 심근 세포를 보장하기 위한 추가 분해 단계가 포함됩니다. 이 방법은 간단하고 빠르게 수행할 수 있으며 기술이 거의 필요하지 않습니다.
Introduction
수십 년 동안 심장 생물학 문헌에서 필수적인 아이디어는 분자 작용 메커니즘입니다. 신뢰할 수 있는 연구를 발표하기 위해서는 행동 메커니즘을 확립해야 합니다. 분자 메커니즘을 결정하기 위한 잘 확립된 전략은 신뢰할 수 있는 데이터를 얻기 위해 고품질 심근 세포가 필요한 분리된 심근 세포 연구입니다. 작용 기전을 결정하기 위해 심근 세포에서 수행되는 세포 및 분자 실험은 수축1, 전기 생리학2, 칼슘 (Ca2+) 사이클링3, 근섬유 Ca2+ 민감도4, 세포 골격5, 대사6, 호르몬 효과7, 신호 분자8, 약물 연구9를 조사하기 위한 황금 표준이다 등. 마우스는 유전자 조작의 용이성, 작은 크기, 상대적으로 짧은 수명, 저렴한 비용 등으로 인해 대부분의 심장 생물학 실험에서 선택되는 종이 되었습니다10. 그러나 고품질 마우스 심근 세포의 안정적인 분리는 현재 기술로는 간단하지 않습니다.
실험실은 거의 70년 동안 심근 세포를 분리해 왔습니다11. 심근 세포를 분리하는 거의 모든 기술은 다양한 효소 (콜라겐 분해 효소, 프로테아제, 트립신 등)를 통한 심장 소화에 의존합니다. 초기(1950년대-1960년대)에는 심장을 제거하고 훨씬 더 작은 조각으로 자르고 콜라게나제/프로테아제/트립신12와 함께 용액에서 배양하는 청크 방법이 사용되었습니다. 1970년대에 실험실은 관상동맥 관류 기반 격리 기술(Langendorff 장치를 통한 효소로 역행 관류)을 사용하여 심근 세포를 분리하는 개선된 “Langendorff” 방법(13)을 구현했습니다. 이 기술은 ~50년 후인 오늘날에도 현장에서 근세포 분리의 지배적인 방법으로 남아 있습니다14,15,16. 최근 연구는 저산소증 시간과 허혈성 손상을 제한하기 위해 생체 내에서 심장을 캐뉼라화하는 것으로 전환되어 우수한 심근 세포 분리(더 나은 수율 및 더 높은 품질)를 초래했습니다17. 최근에, 이것은 생체 내에서, 랑겐도르프가 없는 심장 관류 18,19,20,21,22를 수행하는 것으로 발전하였다. 우리는 Ackers-Johnson et al.18 기술을 기반으로 Langendorff-free 심근 세포 분리 기술을 발전시켰고 이전의 많은 분리 기술에서 다양한 구성 요소를 채택했습니다. 이러한 주요 적응에는 얼음처럼 차가운 제거 완충액을 주입하고 바늘을 안정화하기 위한 지지 플랫폼을 통합하여 심장 조작을 줄이는 것이 포함됩니다. 또한 이 기술에서 상세히 기술된 것은 주입된 완충액(37°C)의 온도 제어이며, 이는 이전에 발표된 바와 같이 더 적은 EDTA 관류로 인해 생체 내 주입과 소화 사이의 시간을 감소시켰다18. 심장의 조작을 줄이고 천자 부위 크기를 최소화함으로써 관상 동맥의 철저하고 지속적인 관류가 이루어집니다. 우리는 또한 2차 청크 분해법으로 기술을 정제하고, 주입된 투명 완충액 중의 EDTA의 양을 측정하고, pH를 변화시켰다. 설명된 기술은 Langendorff 장치를 사용하는 것에 비해 더 안정적이고 효율적이며 광범위한 교육/실습이 필요하지 않습니다(표 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Langendorff-free 심근세포 분리 기술의 주요 장점은 Langendorff 장치에 캐뉼러를 삽입할 필요가 없어 저산소증과 허혈 시간을 제한한다는 것입니다. 심장을 제거, 세척 및 매달아 종종 근세포에 허혈성 손상을 초래하는 고전적인 Langendorff 기법 대신 당사의 방법에는 얼음처럼 차가운 세척 용액을 통한 생체 내 혈액 세척이 포함됩니다. 얼음처럼 차가운 투명 완충액에는 에틸렌디아민테트라…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 국립 보건원 보조금 R01 HL114940 (Biesiadecki), R01 AG060542 (Ziolo) 및 T32 HL134616 (Sturgill and Salyer)의 지원을 받았습니다.
Materials
| 10 cc Bd Luer-Lok Syringe | Fisher Sci | 14-827-52 | |
| 10 mL Pyrex Low-Form Beaker | Cole-Palmer | UX-34502-01 | |
| 100 mL polypropylene cap glass media storage bottle | DWK Life Sciences | UX-34523-00 | |
| 14 mL Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap | Fisher Sci | 14-959-11B | |
| 2,3-Butanedione Monoxime | Sigma | B0753 | >98% |
| 3 cc BD Luer-Lok Syringe | Fisher Sci | 14-823-435 | |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek Corporation | P35G-1.0-20-C | |
| 50 mL BD Syringe without Needle | Fisher Sci | 13-689-8 | |
| 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Cole-Palmer | EW-22999-84 | |
| 95% O2 5% CO2 | |||
| AIMS Space Gel Heating Pad | Fisher Sci | 14-370-223 | |
| BD PrecisionGlide 27 G X 1/2" Hypodermic Needles | Becton Dickinson | 305109 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3803 | Heat shock fraction, lyophilized powder, essentially fatty acid free, >98% |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma | C7902 | >99% |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | Suitable for cell culture, >99.5% |
| DMEM | Fisher Sci | 11965092 | |
| EDTA | Fisher Sci | AAA1071336 | |
| Falcon 100 mm TC-treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
| FBS | R&D Systems (Bio-techne) | S11195 | |
| Fisherbrand Isotemp Heated Immersion Circulators | Fisher Sci | 13-874-432 | |
| Hartman Mosquito Hemostatic Forceps | World Precision Instruments | 15921 | |
| Hausser Scientific Hy-Lite Counting Chamber Set | Fisher Sci | 02-671-11 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | >99.5% |
| Labeling Tape | Fisher Sci | 15-901-10R | |
| Legato 100 Syringe Pump | kdScientific | 788100 | |
| L-glutathione | Fisher Sci | ICN19467980 | |
| Liberase TH Research Grade | Sigma | 5401135001 | High thermolysin concentration |
| M199 | Fisher Sci | MT10060CV | |
| Magnesium Chloride | Invitrogen | AM9530G | |
| Mouse Laminin | Corning | 354232 | |
| Pen/Strep | Fisher Sci | ||
| Potassium Chloride | Sigma | P5405 | >99% |
| Precision Digital Reciprocating Water Bath | ThermoFisher Scientific | TSCIR19 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | Suitable for cell culture |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886 | >99% |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S5011 | >99% |
| Sterile Cell Strainer 70 µm | Fisher Sci | 22-363-548 | |
| Student Fine Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| VWR Absorbent Underpads | Fisher Sci | NC9481815 |
Riferimenti
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