Eine einfache und effektive Methode zur konsistenten Isolierung von Maus-Kardiomyozyten

Summary

Der Goldstandard in der Kardiologie für zelluläre und molekulare Funktionsexperimente sind Kardiomyozyten. Dieser Artikel beschreibt Anpassungen an die Nicht-Langendorff-Technik zur Isolierung von Maus-Kardiomyozyten.

Abstract

Der Bedarf an reproduzierbaren und technisch einfachen Methoden, die qualitativ hochwertige Kardiomyozyten liefern, ist für die Forschung in der Herzbiologie von entscheidender Bedeutung. Zelluläre und molekulare funktionelle Experimente (z. B. Kontraktion, Elektrophysiologie, Kalziumzyklus usw.) an Kardiomyozyten sind der Goldstandard für die Etablierung von Krankheitsmechanismen. Die Maus ist die Spezies der Wahl für funktionelle Experimente und die beschriebene Technik ist speziell für die Isolierung von Maus-Kardiomyozyten. Bisherige Methoden, die einen Langendorff-Apparat erfordern, erfordern ein hohes Maß an Training und Präzision für die Aortenkanülierung, was häufig zu einer Ischämie führt. Das Feld verlagert sich hin zu Langendorff-freien Isolationsmethoden, die einfach und reproduzierbar sind und lebensfähige Myozyten für die physiologische Datenerfassung und Kultur liefern. Diese Methoden verkürzen die Ischämiezeit im Vergleich zur Aortenkanülierung erheblich und führen zu zuverlässig erhaltenen Kardiomyozyten. Unsere Anpassung an die Langendorff-freie Methode umfasst eine initiale Perfusion mit eiskalter Clearing-Lösung, die Verwendung einer stabilisierenden Plattform, die eine stabile Nadel während der Perfusion gewährleistet, und zusätzliche Verdauungsschritte, um zuverlässig gewonnene Kardiomyozyten für den Einsatz in funktionellen Messungen und Kulturen zu gewährleisten. Diese Methode ist einfach und schnell durchzuführen und erfordert wenig technisches Geschick.

Introduction

Eine wesentliche Idee in der herzbiologischen Literatur ist seit Jahrzehnten der molekulare Wirkmechanismus. Der Wirkmechanismus muss etabliert sein, um verlässliche Studien zu veröffentlichen. Eine gut etablierte Strategie zur Bestimmung molekularer Mechanismen sind isolierte Kardiomyozytenstudien, die qualitativ hochwertige Kardiomyozyten benötigen, um vertrauenswürdige Daten zu erhalten. Zelluläre und molekulare Experimente, die an Kardiomyozyten durchgeführt werden, um den Wirkmechanismus zu bestimmen, sind der Goldstandard für die Untersuchung von Kontraktion¹, Elektrophysiologie², Calcium (Ca 2+) -Zyklus³, Myofilament Ca²⁺ Sensitivität⁴, Zytoskelett⁵, Metabolismus⁶, Wirkungen von Hormonen⁷, Signalmoleküle⁸, Arzneimittelstudien⁹ etc. Die Maus ist aufgrund der Leichtigkeit der genetischen Manipulation, ihrer geringen Größe, ihrer relativ kurzen Lebensdauer, ihrer geringen Kosten usw. zur Spezies der Wahl für die meisten herzbiologischen Experimente geworden¹⁰. Die zuverlässige Isolierung hochwertiger Maus-Kardiomyozyten ist jedoch mit den derzeitigen Techniken nicht trivial.

Labore isolieren Kardiomyozyten seit fast 70 Jahren¹¹. Praktisch alle Techniken zur Isolierung von Kardiomyozyten beruhen auf der Verdauung des Herzens über verschiedene Enzyme (Kollagenase, Protease, Trypsin usw.). In den frühen Perioden (1950er bis 1960er Jahre) wurde die Chunk-Methode angewendet, bei der das Herz entfernt, in viel kleinere Stücke geschnitten und in Lösung mit Kollagenase / Protease / Trypsin¹² inkubiert wurde. In den 1970er Jahren implementierten Labore die verbesserte “Langendorff”-Methode¹³, bei der Kardiomyozyten mit einer auf Koronararterienperfusion basierenden Isolationstechnik isoliert wurden (retrograde Perfusion mit Enzym über den Langendorff-Apparat); Diese Technik ist auch heute noch die dominierende Methode der Myozytenisolierung auf diesem Gebiet, ~50 Jahre später^14,15,16. Neuere Arbeiten haben sich auf die Kanülierung des Herzens in vivo verlagert, um die Hypoxiezeit und ischämische Schäden zu begrenzen, was zu überlegenen Kardiomyozytenisolierungen (bessere Ausbeute und höhere Qualität) ^führt17. In jüngster Zeit hat sich dies zu einer in vivo durchgeführten Langendorff-freien Herzperfusion entwickelt 18,19,20,21,22. Wir haben die Langendorff-freie Kardiomyozyten-Isolationstechnik auf Basis der Technik von Ackers-Johnson et ^al.18 weiterentwickelt und verschiedene Komponenten aus den vielen bisherigen Isolationstechniken adaptiert. Zu diesen wichtigen Anpassungen gehören die Injektion eines eiskalten Clearing-Puffers und der Einbau einer Stützplattform zur Stabilisierung der Nadel, die eine verringerte Manipulation des Herzens ermöglicht. Ebenfalls detailliert in dieser Technik ist die Temperaturkontrolle der injizierten Puffer (37 °C), die die Zeit zwischen In-vivo-Injektion und Aufschluss aufgrund einer geringeren EDTA-Perfusion verkürzte, wie zuvor veröffentlicht¹⁸. Durch die Verringerung der Manipulation des Herzens und damit die Minimierung der Größe der Einstichstelle wird eine gründliche und konstante Durchblutung der Koronararterien erreicht. Wir verfeinerten die Technik auch mit einem sekundären Chunk-Aufschluss, der Menge an EDTA im injizierten Clearing-Puffer und änderten den pH-Wert. Unsere beschriebene Technik ist zuverlässiger, effizienter und erfordert im Vergleich zur Verwendung des Langendorff-Geräts keine umfangreiche Ausbildung/Übung (Tabelle 1).

Protocol

Alle in dieser Studie durchgeführten Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Ohio State University in Übereinstimmung mit den NIH-Richtlinien genehmigt. 1. Vorbereitung der Lösung ANMERKUNG: Die Pufferkonzentrationen sind Tabelle 2 zu entnehmen. Präisolation (bis zu 2 Wochen vor der Myozytenisolierung)Perfusionspufferbasis: Bereiten Sie 1 l Perfusionspufferbasis (NaCl, KCl,NaH2…

Representative Results

Es gibt einige Elemente, die bei der Bestimmung des Erfolgs einer Isolation zu berücksichtigen sind. Erstens müssen die Kardiomyozyten stäbchenförmig sein und keine Membranbläschen aufweisen, wie die in Abbildung 1 isolierten Zellen. Eine typische Isolierung ergibt ~80% der Myozyten, die stäbchenförmig sind. Wenn die Isolierung weniger als 50% stäbchenförmige Zellen ergibt, wird dies als erfolglose Isolierung angesehen und Kardiomyozyten werden nicht verwendet. Schließlich sollten …

Discussion

Der Hauptvorteil unserer Langendorff-freien Kardiomyozyten-Isolationstechnik besteht darin, dass sie Hypoxie und ischämische Zeit begrenzt, da keine Kanülierung an einem Langendorff-Gerät erforderlich ist. Alternativ zu den klassischen Langendorff-Techniken, die mehrere Minuten benötigen, um das Herz zu entfernen, zu reinigen und aufzuhängen, was oft zu einer ischämischen Schädigung der Myozyten führt, beinhaltet unsere Methode eine In-vivo-Reinigung des Blutes über eine eiskalte Reinigungslös…

Materials

10 cc Bd Luer-Lok Syringe	Fisher Sci	14-827-52
10 mL Pyrex Low-Form Beaker	Cole-Palmer	UX-34502-01
100 mL polypropylene cap glass media storage bottle	DWK Life Sciences	UX-34523-00
14 mL Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap	Fisher Sci	14-959-11B
2,3-Butanedione Monoxime	Sigma	B0753	>98%
3 cc BD Luer-Lok Syringe	Fisher Sci	14-823-435
35 mm glass bottom dishes	MatTek Corporation	P35G-1.0-20-C
50 mL BD Syringe without Needle	Fisher Sci	13-689-8
50 mL Conical Centrifuge Tubes	Cole-Palmer	EW-22999-84
95% O2 5% CO2
AIMS Space Gel Heating Pad	Fisher Sci	14-370-223
BD PrecisionGlide 27 G X 1/2" Hypodermic Needles	Becton Dickinson	305109
Bovine Serum Albumin	Sigma	A3803	Heat shock fraction, lyophilized powder, essentially fatty acid free, >98%
Calcium Chloride dihydrate	Sigma	C7902	>99%
D-(+)-Glucose	Sigma	G7021	Suitable for cell culture, >99.5%
DMEM	Fisher Sci	11965092
EDTA	Fisher Sci	AAA1071336
Falcon 100 mm TC-treated Cell Culture Dish	Corning	353003
FBS	R&D Systems (Bio-techne)	S11195
Fisherbrand Isotemp Heated Immersion Circulators	Fisher Sci	13-874-432
Hartman Mosquito Hemostatic Forceps	World Precision Instruments	15921
Hausser Scientific Hy-Lite Counting Chamber Set	Fisher Sci	02-671-11
HEPES	Sigma	H4034	>99.5%
Labeling Tape	Fisher Sci	15-901-10R
Legato 100 Syringe Pump	kdScientific	788100
L-glutathione	Fisher Sci	ICN19467980
Liberase TH Research Grade	Sigma	5401135001	High thermolysin concentration
M199	Fisher Sci	MT10060CV
Magnesium Chloride	Invitrogen	AM9530G
Mouse Laminin	Corning	354232
Pen/Strep	Fisher Sci
Potassium Chloride	Sigma	P5405	>99%
Precision Digital Reciprocating Water Bath	ThermoFisher Scientific	TSCIR19
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761	Suitable for cell culture
Sodium Chloride	Sigma	S5886	>99%
Sodium phosphate monobasic	Sigma	S5011	>99%
Sterile Cell Strainer 70 µm	Fisher Sci	22-363-548
Student Fine Scissors	Fine Science Tools	91460-11
VWR Absorbent Underpads	Fisher Sci	NC9481815