सेलुलर और आणविक कार्यात्मक प्रयोगों के लिए कार्डियोलॉजी में स्वर्ण मानक कार्डियोमायोसाइट्स हैं। यह लेख माउस कार्डियोमायोसाइट्स को अलग करने के लिए गैर-लैंगनडॉर्फ तकनीक के अनुकूलन का वर्णन करता है।
कार्डियक जीव विज्ञान में अनुसंधान के लिए उच्च गुणवत्ता वाले कार्डियोमायोसाइट्स उत्पन्न करने वाले प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य लेकिन तकनीकी रूप से सरल तरीकों की आवश्यकता आवश्यक है। कार्डियोमायोसाइट्स पर सेलुलर और आणविक कार्यात्मक प्रयोग (जैसे, संकुचन, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, कैल्शियम साइकिलिंग, आदि) रोग के तंत्र (ओं) की स्थापना के लिए स्वर्ण मानक हैं। माउस कार्यात्मक प्रयोगों के लिए पसंद की प्रजाति है और वर्णित तकनीक विशेष रूप से माउस कार्डियोमायोसाइट्स के अलगाव के लिए है। लैंगनडॉर्फ तंत्र की आवश्यकता वाले पिछले तरीकों को महाधमनी प्रवेशनी के लिए उच्च स्तर के प्रशिक्षण और परिशुद्धता की आवश्यकता होती है, जिसके परिणामस्वरूप अक्सर इस्केमिया होता है। यह क्षेत्र लैंगनडॉर्फ-मुक्त अलगाव विधियों की ओर बढ़ रहा है जो सरल हैं, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं, और शारीरिक डेटा अधिग्रहण और संस्कृति के लिए व्यवहार्य मायोसाइट्स उत्पन्न करते हैं। ये विधियां महाधमनी प्रवेशनी की तुलना में इस्केमिया के समय को बहुत कम कर देती हैं और इसके परिणामस्वरूप मज़बूती से प्राप्त कार्डियोमायोसाइट्स होते हैं। लैंगनडॉर्फ-मुक्त विधि के हमारे अनुकूलन में बर्फ-ठंडा समाशोधन समाधान के साथ एक प्रारंभिक छिड़काव शामिल है, एक स्थिर मंच का उपयोग जो छिड़काव के दौरान एक स्थिर सुई सुनिश्चित करता है, और कार्यात्मक माप और संस्कृति में उपयोग के लिए विश्वसनीय रूप से प्राप्त कार्डियोमायोसाइट्स सुनिश्चित करने के लिए अतिरिक्त पाचन कदम। यह विधि सरल और प्रदर्शन करने के लिए त्वरित है और इसके लिए थोड़ा तकनीकी कौशल की आवश्यकता होती है।
दशकों से, कार्डियक जीवविज्ञान साहित्य में एक आवश्यक विचार कार्रवाई का आणविक तंत्र है। विश्वसनीय अध्ययन प्रकाशित करने के लिए कार्रवाई का तंत्र स्थापित किया जाना चाहिए। आणविक तंत्र को निर्धारित करने के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित रणनीति पृथक कार्डियोमायोसाइट्स अध्ययन है, जिसे भरोसेमंद डेटा प्राप्त करने के लिए उच्च गुणवत्ता वाले कार्डियोमायोसाइट्स की आवश्यकता होती है। कार्रवाई के तंत्र को निर्धारित करने के लिए कार्डियोमायोसाइट्स पर किए गए सेलुलर और आणविक प्रयोग संकुचनकी जांच के लिए स्वर्ण मानक हैं 1, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी2, कैल्शियम (सीए2 +) साइकिल चलाना3, मायोफिलामेंट सीए2 + संवेदनशीलता4, साइटोस्केलेटन5, चयापचय6, हार्मोन7 के प्रभाव, सिग्नलिंग अणु8, दवा अध्ययन9 आदि। माउस आनुवंशिक हेरफेर, इसके छोटे आकार, इसके अपेक्षाकृत कम जीवनकाल, कम लागत आदि की आसानी के कारण अधिकांश कार्डियक जीव विज्ञान प्रयोगों के लिए पसंद की प्रजाति बन गयाहै। हालांकि, उच्च गुणवत्ता वाले माउस कार्डियोमायोसाइट्स का विश्वसनीय अलगाव वर्तमान तकनीकों के साथ तुच्छ नहीं है।
प्रयोगशालाएं लगभग 70 वर्षों से कार्डियोमायोसाइट्स को अलग कर रहीहैं। कार्डियोमायोसाइट्स को अलग करने के लिए लगभग सभी तकनीकें विभिन्न एंजाइमों (कोलेजनेज, प्रोटीज, ट्रिप्सिन, आदि) के माध्यम से हृदय के पाचन पर निर्भर करती हैं। शुरुआती अवधि (1950-1960 के दशक) में, चंक विधि का उपयोग किया गया था, जिसमें हृदय को हटाना, बहुत छोटे टुकड़ों में काटना और कोलेजनेज / प्रोटीज / ट्रिप्सिन12 के साथ समाधान में इनक्यूबेट करना शामिल था। 1970 के दशक में प्रयोगशालाओं ने “लैंगेंडॉर्फ” विधि13 को लागू किया, जिसने कोरोनरी धमनी छिड़काव-आधारित अलगाव तकनीक (लैंगेंडोर्फ तंत्र के माध्यम से एंजाइम के साथ प्रतिगामी छिड़काव) का उपयोग करके कार्डियोमायोसाइट्स को अलग किया; यह तकनीक आज भी क्षेत्र में मायोसाइट अलगाव की प्रमुख विधि बनी हुई है, ~ 50 साल बाद 14,15,16। हाल के काम ने हाइपोक्सिया समय और इस्केमिक क्षति को सीमित करने के लिए विवो में दिल को पतला करने के लिए स्थानांतरित कर दिया है जिसके परिणामस्वरूप बेहतर कार्डियोमायोसाइट अलगाव (बेहतर पैदावार और उच्च गुणवत्ता) 17 है। हाल ही में, यह विवो, लैंगनडॉर्फ-मुक्त हृदय छिड़काव 18,19,20,21,22 में प्रदर्शन में विकसित हुआ है। हमने एकर्स-जॉनसन एट अल.18 तकनीक के आधार पर लैंगेंडॉर्फ-मुक्त कार्डियोमायोसाइट्स अलगाव तकनीक विकसित की है और कई पिछली अलगाव तकनीकों से विभिन्न घटकों को अनुकूलित किया है। इन प्रमुख अनुकूलनों में एक बर्फ-ठंडा समाशोधन बफर का इंजेक्शन और सुई को स्थिर करने के लिए एक सहायक मंच का समावेश शामिल है, जिससे हृदय के हेरफेर में कमी आई है। इस तकनीक में इंजेक्शन बफर (37 डिग्री सेल्सियस) का तापमान नियंत्रण भी विस्तृत है, जिसने पहले प्रकाशित 18 के रूप में कम ईडीटीए छिड़काव के कारण विवो इंजेक्शन और पाचन के बीच के समय को कमकर दिया। हृदय के हेरफेर को कम करके और इसलिए पंचर साइट के आकार को कम करके, कोरोनरी धमनियों का संपूर्ण और निरंतर छिड़काव प्राप्त किया जाता है। हमने तकनीक को द्वितीयक खंड विधि पाचन के साथ भी परिष्कृत किया, इंजेक्शन क्लियरिंग बफर में ईडीटीए की मात्रा, और पीएच को बदल दिया। हमारी वर्णित तकनीक अधिक विश्वसनीय, अधिक कुशल है, और लैंगेंडॉर्फ तंत्र (तालिका 1) का उपयोग करने की तुलना में व्यापक प्रशिक्षण / अभ्यास की आवश्यकता नहीं है।
हमारे लैंगनडॉर्फ-मुक्त कार्डियोमायोसाइट्स अलगाव तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह लैंगेंडॉर्फ तंत्र में प्रवेशनी की आवश्यकता नहीं करके हाइपोक्सिया और इस्केमिक समय को सीमित करता है। वैकल्पिक रूप से शा?…
The authors have nothing to disclose.
इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ ग्रांट्स आर01 एचएल114940 (बिसियाडेकी), आर01 एजी060542 (जिओलो), और टी32 एचएल134616 (स्टरगिल और सालियर) द्वारा समर्थित किया गया था।
10 cc Bd Luer-Lok Syringe | Fisher Sci | 14-827-52 | |
10 mL Pyrex Low-Form Beaker | Cole-Palmer | UX-34502-01 | |
100 mL polypropylene cap glass media storage bottle | DWK Life Sciences | UX-34523-00 | |
14 mL Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap | Fisher Sci | 14-959-11B | |
2,3-Butanedione Monoxime | Sigma | B0753 | >98% |
3 cc BD Luer-Lok Syringe | Fisher Sci | 14-823-435 | |
35 mm glass bottom dishes | MatTek Corporation | P35G-1.0-20-C | |
50 mL BD Syringe without Needle | Fisher Sci | 13-689-8 | |
50 mL Conical Centrifuge Tubes | Cole-Palmer | EW-22999-84 | |
95% O2 5% CO2 | |||
AIMS Space Gel Heating Pad | Fisher Sci | 14-370-223 | |
BD PrecisionGlide 27 G X 1/2" Hypodermic Needles | Becton Dickinson | 305109 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A3803 | Heat shock fraction, lyophilized powder, essentially fatty acid free, >98% |
Calcium Chloride dihydrate | Sigma | C7902 | >99% |
D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | Suitable for cell culture, >99.5% |
DMEM | Fisher Sci | 11965092 | |
EDTA | Fisher Sci | AAA1071336 | |
Falcon 100 mm TC-treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
FBS | R&D Systems (Bio-techne) | S11195 | |
Fisherbrand Isotemp Heated Immersion Circulators | Fisher Sci | 13-874-432 | |
Hartman Mosquito Hemostatic Forceps | World Precision Instruments | 15921 | |
Hausser Scientific Hy-Lite Counting Chamber Set | Fisher Sci | 02-671-11 | |
HEPES | Sigma | H4034 | >99.5% |
Labeling Tape | Fisher Sci | 15-901-10R | |
Legato 100 Syringe Pump | kdScientific | 788100 | |
L-glutathione | Fisher Sci | ICN19467980 | |
Liberase TH Research Grade | Sigma | 5401135001 | High thermolysin concentration |
M199 | Fisher Sci | MT10060CV | |
Magnesium Chloride | Invitrogen | AM9530G | |
Mouse Laminin | Corning | 354232 | |
Pen/Strep | Fisher Sci | ||
Potassium Chloride | Sigma | P5405 | >99% |
Precision Digital Reciprocating Water Bath | ThermoFisher Scientific | TSCIR19 | |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | Suitable for cell culture |
Sodium Chloride | Sigma | S5886 | >99% |
Sodium phosphate monobasic | Sigma | S5011 | >99% |
Sterile Cell Strainer 70 µm | Fisher Sci | 22-363-548 | |
Student Fine Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
VWR Absorbent Underpads | Fisher Sci | NC9481815 |