En enkel og effektiv metode for konsekvent å isolere muskardiomyocytter

Summary

Gullstandarden i kardiologi for cellulære og molekylære funksjonelle eksperimenter er kardiomyocytter. Denne artikkelen beskriver tilpasninger til ikke-Langendorff-teknikken for å isolere musekardiomyocytter.

Abstract

Behovet for reproduserbare, men teknisk enkle metoder som gir kardiomyocytter av høy kvalitet, er essensielt for forskning innen hjertebiologi. Cellulære og molekylære funksjonelle eksperimenter (f.eks. Sammentrekning, elektrofysiologi, kalsiumsykling, etc.) på kardiomyocytter er gullstandarden for å etablere sykdomsmekanisme(r). Musen er den valgte arten for funksjonelle eksperimenter, og den beskrevne teknikken er spesielt for isolering av musekardiomyocytter. Tidligere metoder som krever et Langendorff-apparat krever høy trening og presisjon for kanylering av aorta, noe som ofte resulterer i iskemi. Feltet skifter mot Langendorff-frie isolasjonsmetoder som er enkle, er reproduserbare og gir levedyktige myocytter for fysiologisk datainnsamling og kultur. Disse metodene reduserer iskemitiden sterkt sammenlignet med aortakanylering og resulterer i pålitelig oppnådde kardiomyocytter. Vår tilpasning til den Langendorff-frie metoden inkluderer en innledende perfusjon med iskald renseløsning, bruk av en stabiliseringsplattform som sikrer en jevn nål under perfusjon, og ytterligere fordøyelsestrinn for å sikre pålitelig oppnådde kardiomyocytter for bruk i funksjonelle målinger og kultur. Denne metoden er enkel og rask å utføre og krever lite teknisk dyktighet.

Introduction

I flere tiår er en viktig idé i hjertebiologisk litteratur den molekylære virkningsmekanismen. Virkningsmekanismen må etableres for å publisere pålitelige studier. En veletablert strategi for å bestemme molekylær mekanisme er isolerte kardiomyocyttstudier, som krever kardiomyocytter av høy kvalitet for å oppnå pålitelige data. Cellulære og molekylære eksperimenter utført på kardiomyocytter for å bestemme virkningsmekanismen er gullstandarden for å undersøke sammentrekning¹, elektrofysiologi², kalsium (Ca 2+) syklus³, myofilament Ca²⁺ følsomhet⁴, cytoskjelett⁵, metabolisme⁶, effekter av hormoner⁷, signalmolekyler⁸, legemiddelstudier⁹ etc. Musen har blitt den valgte arten for de fleste hjertebiologiske eksperimenter på grunn av den enkle genetiske manipulasjonen, den lille størrelsen, den relativt korte levetiden, lave kostnader, etc¹⁰. Den pålitelige isoleringen av høykvalitets musekardiomyocytter er imidlertid ikke triviell med dagens teknikker.

Laboratorier har isolert kardiomyocytter i nesten 70 år¹¹. Nesten alle teknikker for å isolere kardiomyocytter er avhengige av fordøyelsen av hjertet via forskjellige enzymer (kollagenase, protease, trypsin, etc.). I de tidlige periodene (1950-1960-tallet) ble chunk-metoden benyttet, som innebar å fjerne hjertet, kutte i mye mindre biter og inkubere i løsning med kollagenase / protease / trypsin¹². På 1970-tallet implementerte laboratorier den forbedrede “Langendorff” -metoden¹³, som isolerte kardiomyocytter ved hjelp av en perfusjonsbasert isolasjonsteknikk i kranspulsårene (retrograd perfusjon med enzym via Langendorff-apparatet); Denne teknikken er fortsatt den dominerende metoden for myocytisolering i feltet i dag, ~ 50 år senere^14,15,16. Nylig arbeid har skiftet til kanylering av hjertet in vivo for å begrense hypoksitid og iskemisk skade som resulterer i overlegne kardiomyocyttisolasjoner (bedre utbytter og høyere kvalitet)¹⁷. Nylig har dette utviklet seg til å utføre in vivo, Langendorff-frie hjerteperfusjoner 18,19,20,21,22. Vi har utviklet Langendorff-fri kardiomyocyttisolasjonsteknikk basert på Ackers-Johnson et ^{al.18-teknikken} og tilpasset ulike komponenter fra de mange tidligere isolasjonsteknikkene. Disse viktige tilpasningene inkluderer injeksjon av en iskald ryddebuffer og inkorporering av en støtteplattform for å stabilisere nålen, noe som muliggjør redusert manipulering av hjertet. Også detaljert i denne teknikken er temperaturkontroll av injiserte buffere (37 ° C), noe som reduserte tiden mellom in vivo injeksjon og fordøyelse på grunn av mindre EDTA-perfusjon som tidligere publisert¹⁸. Ved å redusere manipulering av hjertet og dermed minimere punkteringsstedets størrelse, oppnås grundig og konstant perfusjon av koronararteriene. Vi raffinerte også teknikken med en sekundær chunk method fordøyelse, mengden EDTA i den injiserte clearingbufferen, og endret pH. Vår beskrevne teknikk er mer pålitelig, mer effektiv og krever ikke den omfattende opplæringen / øvelsen sammenlignet med bruk av Langendorff-apparatet (tabell 1).

Protocol

Alle prosedyrer utført i denne studien ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Ohio State University i samsvar med NIHs retningslinjer. 1. Forberedelse av løsning MERK: Se tabell 2 for bufferkonsentrasjoner. Preisolering (inntil 2 uker før myocyttisolering)Perfusjonsbufferbase: Klargjør 1 liter perfusjonsbufferbase (NaCl, KCl, NaH 2 PO 4, HEPES, glukose og BDM) i 1 liter ultraren 18,2 M?…

Representative Results

Det er noen elementer å undersøke når man bestemmer suksessen til en isolasjon. Først må kardiomyocyttene være stavformede uten membranbleb, slik cellene isolert i figur 1. En typisk isolasjon vil gi ~ 80% av myocyttene er stavformede. Hvis isolasjonen gir noe mindre enn 50% stavformede celler, anses det som en mislykket isolasjon og kardiomyocytter brukes ikke. Til slutt bør kardiomyocyttene være hvilende. Spontane sammentrekningsmyocytter viser Ca2+-intoleranse og vil gi upåliteli…

Discussion

Hovedfordelen med vår Langendorff-frie kardiomyocyttisolasjonsteknikk er at den begrenser hypoksi og iskemisk tid ved ikke å kreve kanylering til et Langendorff-apparat. Alternativt til klassiske Langendorff-teknikker som tar flere minutter å fjerne, rense og henge hjertet, noe som ofte resulterer i iskemisk skade på myocytten, inkluderer vår metode en in vivo clearing av blod via en iskald clearingløsning. Den iskalde clearingbufferen inneholder etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), irreversibelt ch…

Materials

10 cc Bd Luer-Lok Syringe	Fisher Sci	14-827-52
10 mL Pyrex Low-Form Beaker	Cole-Palmer	UX-34502-01
100 mL polypropylene cap glass media storage bottle	DWK Life Sciences	UX-34523-00
14 mL Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap	Fisher Sci	14-959-11B
2,3-Butanedione Monoxime	Sigma	B0753	>98%
3 cc BD Luer-Lok Syringe	Fisher Sci	14-823-435
35 mm glass bottom dishes	MatTek Corporation	P35G-1.0-20-C
50 mL BD Syringe without Needle	Fisher Sci	13-689-8
50 mL Conical Centrifuge Tubes	Cole-Palmer	EW-22999-84
95% O2 5% CO2
AIMS Space Gel Heating Pad	Fisher Sci	14-370-223
BD PrecisionGlide 27 G X 1/2" Hypodermic Needles	Becton Dickinson	305109
Bovine Serum Albumin	Sigma	A3803	Heat shock fraction, lyophilized powder, essentially fatty acid free, >98%
Calcium Chloride dihydrate	Sigma	C7902	>99%
D-(+)-Glucose	Sigma	G7021	Suitable for cell culture, >99.5%
DMEM	Fisher Sci	11965092
EDTA	Fisher Sci	AAA1071336
Falcon 100 mm TC-treated Cell Culture Dish	Corning	353003
FBS	R&D Systems (Bio-techne)	S11195
Fisherbrand Isotemp Heated Immersion Circulators	Fisher Sci	13-874-432
Hartman Mosquito Hemostatic Forceps	World Precision Instruments	15921
Hausser Scientific Hy-Lite Counting Chamber Set	Fisher Sci	02-671-11
HEPES	Sigma	H4034	>99.5%
Labeling Tape	Fisher Sci	15-901-10R
Legato 100 Syringe Pump	kdScientific	788100
L-glutathione	Fisher Sci	ICN19467980
Liberase TH Research Grade	Sigma	5401135001	High thermolysin concentration
M199	Fisher Sci	MT10060CV
Magnesium Chloride	Invitrogen	AM9530G
Mouse Laminin	Corning	354232
Pen/Strep	Fisher Sci
Potassium Chloride	Sigma	P5405	>99%
Precision Digital Reciprocating Water Bath	ThermoFisher Scientific	TSCIR19
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761	Suitable for cell culture
Sodium Chloride	Sigma	S5886	>99%
Sodium phosphate monobasic	Sigma	S5011	>99%
Sterile Cell Strainer 70 µm	Fisher Sci	22-363-548
Student Fine Scissors	Fine Science Tools	91460-11
VWR Absorbent Underpads	Fisher Sci	NC9481815