Områdebasert bildeanalysealgoritme for kvantifisering av makrofag-fibroblastkokulturer

Summary

Vi presenterer en metode, som benytter en generaliserbar områdebasert bildeanalysetilnærming for å identifisere celleantall. Analyse av ulike cellepopulasjoner utnyttet de signifikante cellehøyde- og strukturforskjellene mellom distinkte celletyper i en adaptiv algoritme.

Abstract

Kvantifisering av celler er nødvendig for et bredt spekter av biologiske og biokjemiske studier. Konvensjonell bildeanalyse av celler bruker vanligvis enten fluorescensdeteksjonsmetoder, for eksempel immunfluorescerende farging eller transfeksjon med fluorescerende proteiner eller kantdeteksjonsteknikker, som ofte er feilutsatte på grunn av støy og andre ikke-idealiteter i bildebakgrunnen.

Vi designet en ny algoritme som nøyaktig kunne telle og skille makrofager og fibroblaster, celler av forskjellige fenotyper som ofte colokaliserer under vevregenerering. MATLAB ble brukt til å implementere algoritmen, som differensierte forskjellige celletyper basert på høydeforskjeller fra bakgrunnen. En primæralgoritme ble utviklet ved hjelp av en områdebasert metode for å gjøre rede for variasjoner i cellestørrelse/struktur og seedingforhold med høy tetthet.

Ikke-idealiteter i cellestrukturer ble gjort rede for med en sekundær, iterativ algoritme ved hjelp av interne parametere som celledekning beregnet ved hjelp av eksperimentelle data for en gitt celletype. Til slutt ble det utført en analyse av kokulturmiljøer ved hjelp av en isolasjonsalgoritme der ulike celletyper ble selektivt utelukket basert på evaluering av relative høydeforskjeller i bildet. Denne tilnærmingen ble funnet å telle celler nøyaktig innenfor en 5% feilmargin for monokulturerte celler og innenfor en 10% feilmargin for kokulturerte celler.

Introduction

Programvare implementeres rutinemessig under bildeanalyseteknikker for å sikre at resultatene er nøyaktige, effektive og objektive. For cellebaserte analyser er et vanlig problem misidentifisering av celler. Bilder med feil innstillinger for fokus og kontrast kan føre til uskarphet i cellen, der grensen til enkeltceller blir vanskelig å identifisere¹. Tilstedeværelsen av fremmede bildefunksjoner som porer, bobler eller andre uønskede objekter kan hemme telleprosedyrer ved å bremse telleprosessen og føre til misidentifisering. Videre kan celletelling være onerous, og å telle hundrevis av replikeringer kan være ekstremt tidkrevende. Videre eksisterer en iboende subjektiv skjevhet under manuell telling, og derfor er beslutningstaking angående celleidentifikasjon ofte unøyaktig². Automatisert programvare gir spennende potensial til å omgå alle disse problemene ved raskt og presist å differensiere celler fra fremmede objekter, inkludert objekter langt utover menneskelig kapasitet for presis deteksjon, basert på veldefinerte identifikasjonskriterier som reduserer påvirkningen av undersøkerbias. Vanlige teknikker for å identifisere celler ved hjelp av automatisert programvare involverer to hovedmetoder: segmentering og terskel³. Heri demonstrerer vi en generaliserbar områdebasert protokoll som muliggjør rask, nøyaktig og billig celletelling innenfor et allment tilgjengelig programvarerammeverk.

Segmenteringsteknikker, for eksempel kantdeteksjon, søker å isolere enkeltceller ved å bruke intensitetsforskjeller i et bilde. Intensitetsendringer som skiller en celle fra resten av bildet, består oftest av skarpe endringer i lysstyrke⁴. Kantdeteksjon innebærer et filtreringstrinn som skjer regelmessig, etterfulgt av et differensieringstrinn der intensitetsendringer oppdages. Differensieringsprosessen identifiserer kanter og konturer i bildet av endringer med høy intensitet, og disse kantene og konturene er korrelert med celletilstedeværelsen. Selv om bilder med støy kan kjøres gjennom denoising algoritmer⁴, er kantdeteksjonsteknikker ideelt brukt til å analysere bilder med lav bakgrunnsstøy. Prosessen fungerer optimalt når cellegrenser er klart og lett å skille mellom og ikke hindres av lysstyrkekonturer som ikke er relatert til celletilstedeværelse, celleuskarphet, fremmede objekter eller definerte interne cellestrukturer ^1,2. Hvis et bilde er spesielt støyende, kan cellene ytterligere skille seg ut gjennom fluorescerende farging eller transfeksjon med fluorescerende proteiner ^2,5. Selv om dette forbedrer nøyaktigheten av segmenteringsteknikker betydelig, krever det ekstra kostnader og ekstra tidsinvesteringer for å forberede cellekulturer for avbildning.

Terskelverditeknikker omfatter oppdeling av et bilde i to kategorier: forgrunnen og bakgrunnen, med celler tilordnet forgrunnen³. Disse teknikkene bruker farge-/kontrastendringer for å definere den tilsynelatende høyden på et objekt. -objekter som rutinemessig er “høyere” enn bakgrunnen, kan enkelt identifiseres som celler. Vannskillet fungerer på denne måten ved å knytte overflater til lyse bildepunkter som forgrunnen og de med mørke bildepunkter som bakgrunn ^6,7. Gjennom høydebasert identifikasjon kan terringsteknikker rutinemessig skille støy fra ønskede objekter, forutsatt at de eksisterer innenfor samme fokusplan. Når den er parkoblet med en områdebasert kvantifisering, kan en vannskilletransformasjon nøyaktig identifisere grupper av objekter i miljøer der typiske segmenteringsteknikker, for eksempel kantdeteksjon, vil være unøyaktige.

Vannskilletransformasjoner kombineres vanligvis med segmenteringsteknikker for å forberede bilder for en renere analyse, noe som resulterer i høyere nøyaktighet av celletelling. For denne prosessen brukes vannskilletransformasjonen til å fremheve potensielle interesseområder før segmentering. En vannskilletransformasjon gir unike fordeler ved å identifisere celler i forgrunnen av bilder, noe som kan forbedre nøyaktigheten av segmenteringsanalysen ved å fjerne potensielle falske positiver for celler, for eksempel ujevne bakgrunner. Det kan imidlertid oppstå vanskeligheter når du prøver å tilpasse cellebaserte bilder til en vannskilletransformasjon. Bilder med høy celletetthet kan plages med undersegmentering, der cellemengder identifiseres som en entallsgruppe i stedet for som individuelle komponenter. Tilstedeværelsen av støy eller skarpe intensitetsendringer kan også resultere i oversegmentering, der algoritmen overisolerer celler, noe som resulterer i overdreven og unøyaktig celle teller⁸.

Heri beskriver vi en metode for å minimere de primære ulempene ved vannskilletransformasjonen ved å inkorporere komponenter i en terskelanalyse i en områdebasert kvantifiseringsalgoritme, som vist i figur 1. Spesielt ble denne algoritmen implementert med åpen kildekode og / eller allment tilgjengelig programvare, og anvendelse av dette celletellingsrammeverket var mulig uten dyre reagenser eller komplekse celleforberedelsesteknikker. RAW264.7 makrofager ble brukt til å demonstrere metoden på grunn av deres kritiske rolle i regulering av vedlikehold av bindevev og sårhelingsprosesser⁹. I tillegg ble NIH/3T3 fibroblaster analysert på grunn av deres nøkkelrolle i vevsvedlikehold og reparasjon. Fibroblastceller sameksisterer ofte med og støtter makrofager, og genererer behovet for å skille disse fenotypisk distinkte celletypene i kokulturstudier.

Celleantall fra bilder med høy levedyktig celletetthet (VCD) kan kvantifiseres pålitelig og effektivt ved å beregne området som dekkes av cellene, og gjennomsnittsområdet okkupert av en entall celle. Bruk av terring i motsetning til segmentering for celleidentifikasjon gjorde det også mulig med mer komplekse analyser, for eksempel eksperimenter der ulike celletyper i kokulturer ble analysert samtidig. NIH/3T3 fibroblaster, som ofte er funnet å colokalisere med RAW264.7 makrofager i et sårhelingssted, ble funnet å vokse på et fokusplan som var forskjellig fra fokusplanet til makrofager¹⁰. Følgelig ble flere terningsalgoritmer kjørt for å definere bakgrunnen og forgrunnen avhengig av celletypen som analyseres, noe som muliggjør nøyaktig telling av to forskjellige celletyper i samme bilde.

Protocol

1. Cellekultur og bildeoppkjøp Kultur RAW264.7 makrofager ved 37 °C og 5 % CO2 i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) supplert med 10 % foster bovint serum (FBS), 1 % penicillin-streptomycin, 1,5 g/l natriumbikarbonat og 5 μM β-mercaptoetanol. For monokulturavbildning, kultur RAW264.7 celler med en tetthet på 25,000 celler /cm2 i en 5 ml cellekultur kolbe med 1 ml medium. Kultur NIH/3T3 celler ved 37 °C og 5 % CO2 i DMEM su…

Representative Results

Analyse av ikke-bulbous RAW264.7 makrofager ble utført i en monokulturinnstilling ved 25.000 celler / cm2. Representative bilder ble tatt av cellekulturen og behandlet i MATLAB etter konvertering til 8-biters tiff i ImageJ. Algoritmeutganger gjennom hele prosessen ble registrert og dokumentert i figur 2 for det representative bildet. I dette bildet telte algoritmen 226 celler, og dette bildeantallet ble bekreftet ved sammenligning med et manuelt antall som identifiserte 241 celle…

Discussion

Vi designet en generell områdebasert prosedyre som nøyaktig og effektivt telte celler på grunnlag av cellehøyde, noe som muliggjør flekkfri mengde celler selv i kokultursystemer. Kritiske trinn for denne prosedyren inkluderte implementeringen av et relativ intensitetssystem der celler kunne differensieres. Bruken av en relativ høydeanalyse tjente to formål: Behovet for eksterne parametere ble gjort unødvendig, da relative parametere var konstante for den gitte celletypen og parameteren, og absolutt lysstyrke / ko…

Materials

Axio Observer 7 Inverted Microscope	Zeiss	1028290770
β-mercaptoethanol	Life Technologies	21985023
Cell Scrapers	CellTreat	229310
Dublecco's Modified Eagle Medium	Fisher Scientific	12430047
Dublecco's PBS	Fisher Scientific	14190144
MATLAB Software	MathWorks	2021A
NIH/3T3 Cells	ATCC	ATCC CRL – 1658
Penicillin–Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333-20ML
RAW264.7 Cells	ATCC	ATCC TIB – 71
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S6014-25G
T75 Cell Culture Flask	Corning	CLS3814-24EA