Überwachung des Brustkrebswachstums und der metastasierenden Koloniebildung bei Mäusen mittels Biolumineszenz
Summary
Hier beschreiben wir eine nichtinvasive Überwachungsmethode, die Luciferase und grün fluoreszierende Proteinexpression in verschiedenen Brustkrebszelllinien beinhaltet. Dieses Protokoll bietet eine Technik zur Überwachung der Tumorbildung und der metastasierenden Besiedlung in Echtzeit bei Mäusen.
Abstract
Brustkrebs ist eine häufige heterogene Malignität und die zweithäufigste Todesursache bei Frauen, hauptsächlich aufgrund von entfernten Organmetastasen. Es wurden mehrere Tiermodelle erstellt, darunter die weit verbreiteten orthotopen Mausmodelle, bei denen Krebszellen in das Brustfettpolster injiziert werden. Diese Modelle können jedoch nicht dazu beitragen, die Kinetik des Tumorwachstums und die metastasierende Besiedlung zu überwachen. Modernste Werkzeuge zur Echtzeitüberwachung von Krebszellen in Mäusen werden das Verständnis der Tumorbiologie erheblich verbessern.
Hier wurden Brustkrebszelllinien etabliert, die Luziferase und grün fluoreszierendes Protein (GFP) stabil exprimieren. Insbesondere enthält diese Technik zwei aufeinanderfolgende Schritte, die durch die Messung der Luciferase-Aktivität in vitro eingeleitet werden, gefolgt von der Implantation der Krebszellen di Brustfettpolster von nicht fettleibigen diabetisch-schweren kombinierten Immunschwächemäusen (NOD-SCID). Nach der Injektion werden sowohl das Tumorwachstum als auch die metastasierende Besiedlung in Echtzeit durch das nichtinvasive Biolumineszenz-Bildgebungssystem überwacht. Dann wird die Quantifizierung von GFP-exprimierenden Metastasen in der Lunge mittels Fluoreszenzmikroskopie untersucht, um die beobachteten Biolumineszenzergebnisse zu validieren. Dieses ausgeklügelte System, das Luciferase und fluoreszenzbasierte Erkennungswerkzeuge kombiniert, bewertet Krebsmetastasen in vivo, was ein großes Potenzial für den Einsatz in Brustkrebstherapeutika und Krankheitsmanagement hat.
Introduction
Brustkrebs ist weltweit eine häufige Krebsart, mit etwa 250.000 neuen Fällen, die jedes Jahr in den Vereinigten Staaten diagnostiziertwerden 1. Trotz seiner hohen Inzidenz hat eine neue Reihe von Krebsmedikamenten die Ergebnisse von Brustkrebspatientinnen signifikant verbessert2. Diese Behandlungen sind jedoch immer noch unzureichend, da viele Patienten einen Krankheitsrückfall und eine metastatische Ausbreitung auf lebenswichtige Organe2 erfahren, was die Hauptursache für die Morbidität und Mortalität der Patienten ist. Daher besteht eine der größten Herausforderungen in der Brustkrebsforschung darin, die molekularen Mechanismen zu identifizieren, die die Bildung von distalen Metastasen regulieren, um neue Mittel zur Hemmung ihrer Entwicklung zu entwickeln.
Krebsmetastasen sind ein dynamischer Prozess, bei dem sich Zellen vom Primärtumor lösen und durch den Blutkreislauf in benachbarte Gewebe eindringen. So können Tiermodelle, in denen die Zellen eine ähnliche metastatische Kaskade durchlaufen, die Identifizierung der Mechanismen erleichtern, die diesen Prozess steuern 3,4. Darüber hinaus sind diese In-vivo-Modelle für die Entwicklung von Brustkrebstherapeutikaunerlässlich 5,6. Diese orthotopen Modelle können jedoch nicht auf die tatsächliche Kinetik des Tumorwachstums hinweisen, da der Effekt erst bei Beendigung bestimmt wird. Daher haben wir ein Luciferase-basiertes Tool entwickelt, um Tumorentwicklung und metastasierende Besiedlung in Echtzeit zu erkennen. Zusätzlich exprimieren diese Zellen GFP, um die metastatischen Kolonien zu erkennen. Dieser Ansatz ist relativ einfach und beinhaltet keine invasiven Verfahren3. Daher ist die Kombination von Luciferase- und Fluoreszenzdetektion eine hilfreiche Strategie, um die präklinischen Studien von Brustkrebstherapeutika und Krankheitsmanagement voranzutreiben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tierversuche sind für die Krebsforschungobligatorisch 7,8,9, und in der Tat wurden viele Protokolle entwickelt 3,6,10,11,12,13,14. Die meisten dieser Studien bestimmten die biologische Wirkung jedo…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken den Mitgliedern des Y.D.S.-Labors. Wir danken dem Wohl Institute for Translational Medicine am Hadassah Medical Center, Jerusalem, für die Bereitstellung der Kleintierbildgebungsanlage. Diese Studie wurde durch den Research Career Development Award des Israel Cancer Research Fund unterstützt.
Materials
| 1.7 mL eppendorf tubes | Lifegene | LMCT1.7B-500 | |
| 10 µL tips | Lifegene | LRT10 | |
| 1000 µL tips | Lifegene | LRT1000 | |
| 15 mL tubes | Lifegene | LTB15-500 | |
| 200 µL tips | Lifegene | LRT200 | |
| 6 well cell culture plate | COSTAR | 3516 | |
| 96 well Plates BLACK flat bottom | Bar Naor | BN30496 | |
| Automated Cell Counters | Thermofisher | A50298 | |
| BD FACSAria III sorter | BD | ||
| BD Microlance 3 Needles 27 G (3/4'') | BD | 302200 | |
| BD Plastipak Syringes 1 mL x 120 | BD | 303172 | |
| Corning 100 mm x 20 mm Style Dish | CORNING | 430167 | |
| Corning 150 mm x 20 mm Style Dish | CORNING | 430599 | |
| Countess cell counting chamber slides | Thermofisher | C10228 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), high glucose, no glutamine | Biological Industries | 01-055-1A | |
| Eclipse 80i microscope | Nikon | ||
| eppendorf Centrifuge 5810 R | Sigma Aldrich | EP5820740000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biological Industries | 04-127-1A | |
| FUW GFP | Gifted from Dr. Yossi Buganim's lab (Hebrew University of Jerusalem) | ||
| HEK293T | Gifted from Dr. Lior Nissim's lab (Hebrew University of Jerusalem) | ||
| Isoflurane, USP Terrell | Piramal | NDC 66794-01-25 | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| L-Glutamine Solution | Biological industries | 03-020-1A | |
| Living Image Software | PerkinElmer | bioluminescence measurement | |
| MCF-7 | ATCC | ATCC HTB-22 | |
| MDA-MB-231 | ATCC | ATCC HTB-26 | |
| MDA-MB-468 | ATCC | ATCC HTB-132 | |
| Pasteur pipettes | NORMAX | 2430-475 | |
| PBS | Hylabs | BP655/500D | |
| pCMV-dR8.2-dvpr | Addgene | #8455 | Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA) |
| pCMV-VSV-G | Addgene | #8454 | Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA) |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| Petri dish 90 mm (90×15) | MINI PLAST | 820-090-01-017 | |
| Pipettes 10ml | Lifegene | LG-GSP010010S | |
| Pipettes 25ml | Lifegene | LG-GSP010050S | |
| Pipettes 5ml | Lifegene | LG-GSP010005S | |
| pLX304 Luciferase-V5 blast plasmid | Addgene | #98580 | |
| Polybrene | Sigma Aldrich | #107689 | |
| Prism 9 | GraphPad | ||
| Reagent Reservoirs | Bar Naor | BN20621STR200TC | |
| SMZ18 Stereo microscopes | Nikon | ||
| Sodium Chloride | Bio-Lab | 190359400 | |
| Syringe filters | Lifegene | LG-FPV403030S | |
| Trypan Blue 0.5% solution | Biological industries | 03-102-1B | |
| Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%) | Biological Industries | 03-052-1a | |
| Vacuum driven Filters | SOFRA LIFE SCIENCE | SPE-22-500 | |
| Virusolve | disinfectant | ||
| VivoGlo Luciferin, In Vivo Grade | Promega | P1043 | |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent | Sigma Aldrich | #6366236001 |
Riferimenti
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