使用晶体紫改善使用 TCID50 检测法进行病毒滴定的基于视觉细胞病变效应的读数
Summary
该协议显示了一种准确客观的方法，通过将晶体紫与光学显微镜和免疫细胞化学染色进行比较，可视化病毒滴定。
Abstract
病毒滴定是病毒学研究的关键检测方法。 通过 TCID50 检测和斑块形成单元 （PFU） 检测细胞病变效应 （CPE） 是计算病毒储备滴度的两种主要方法，通常基于显微镜检测或细胞染色进行可视化。在 TCID50 测定的情况下，客观可视化通常基于细胞内病毒的免疫细胞化学 （ICC） 染色，以计算滴度， 并通过显微镜进行 视觉 CPE 检测。然而，ICC染色既昂贵又耗时。在这项研究中，我们比较了 通过 显微镜，ICC染色和结晶紫染色的视觉CPE观察，以确定两种CPE形成病毒的滴度，猪源性甲型流感病毒（IAV）和猪繁殖和呼吸综合征病毒（PRRSV）。我们表明，结晶紫和ICC染色都比视觉CPE检测更准确，在IAV和PRRSV上呈现几乎相同的精度水平。出于这个原因，在这里，我们将结晶紫染色作为一种更快，更实惠的方法，用于在TCID50测定中测定细胞系中滴定的CPE形成病毒。
Introduction
通过 TCID50 测定进行病毒滴定是传染病研究中常用的技术1。尽管随着时间的推移，已经提出了该方法背后的数学变化1，2，3，4，但目前应用的感染检测方法依赖于通过使用显微镜的细胞病变效应（CPE）的存在进行视觉确认5。为了在 TCID50 测定中更客观地确认 CPE 可视化，靶向病毒蛋白的免疫细胞化学 （ICC） 细胞内染色是最常用的方法之一6，因为不同的病毒可以产生不同形式的 CPE。在我们的例子中，当感染甲型流感病毒（IAV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）时，细胞形态变化是相似的，其中受感染的细胞从板中聚集并分离。在PRRSV的情况下，它会导致称为”完全破坏”的CPE，其中所有细胞最终都从孔中分离出来。另一方面，IAV可以同时存在完全破坏和称为”次级破坏”的额外CPE，其中少量细胞在感染后不会分离7。然而，这种技术执行起来非常耗时，并且需要使用相对昂贵的试剂。重要的是要注意，ICC不标记CPE，而是标记被病毒成功感染的细胞数量。这意味着，即使感染尚未引起CPE，在孵育结束时成功感染的细胞也将被视为阳性，因此，与CPE相比，ICC阳性细胞的比例更高。出于这个原因，在这项研究中，我们描述了一种基于晶体紫的TCID50测定中CPE视觉检测的补充方法，晶体紫是一种具有正电荷的化学物质，附着在细胞膜上并用于染色贴壁细胞。晶体紫通常用于病毒学研究，以测量斑块形成单位等8。
在这项研究中，我们将非染色显微镜CPE检测与基于病毒蛋白识别的结晶紫染色和免疫细胞化学染色的灵敏度进行了比较，由于其高灵敏度，已知其更客观。该研究表明，结晶紫染色和免疫细胞化学染色都比基于视觉显微镜的CPE检测更准确，可用于在TCID50滴定中客观地鉴定感染孔。鉴于它们在细胞系中测试的细胞病变病毒上能够达到几乎相同的准确度，因此晶体紫被呈现为在TCID50测定中测定病毒滴定更快，更实惠的方法。所提出的使用晶体紫染色的方法需要40分钟的总时间，多聚甲醛（PFA）孵育15分钟，晶体紫孵育5分钟，材料制备，缓冲液洗涤和干燥最长15分钟。用于比较的免疫细胞化学方案平均需要4小时30分钟的时间，并如前所述进行9，10。所提出的方法旨在帮助可视化完成的病毒滴定。感染和潜伏时间可以根据病毒的不同布局进行。在这里，我们测试了两种对细胞系具有细胞病变作用的RNA病毒。
Protocol
Representative Results
Discussion
病毒滴定法通常用于病毒学研究，最常用的是PFU检测和TCID50测定1，2，3，4。这两种方法都依赖于感染细胞中CPE的检测，即使 可以通过显微镜对 它们进行视觉评估，通常也要进行染色以获得更客观的结果，甚至减少孵育时间。就 TCID50 而言，ICC 染色是视觉 CPE 检测最常用的替代方法之一，可提?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者要感谢Frank Scholle博士在手稿中的有益评论，Chloe Mariant对显微镜图像的帮助以及Teresa M. Tiedge对她有用的英文修订。
Materials
| 96-well cell culture plates | Genesee | 25-221 | Clear, flat bottom |
| AEC solution | Thermo Fisher | 1122 | |
| Crystal violet | Thermo Fisher | C581-25; C581-100 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum | BioWest | S1480 | |
| Paraformaldehide | Thermo Fisher | J19943 | |
| Primary Influenza Antibody | Bioss | BS-0344R | |
| Primary PRRSV Antibody | Bioss | BS-10043R | |
| Saponin | Thermo Scientific | AAA1882014 | |
| Secondaty antibody | Invitrogen | 31460 | |
| Tris Hydrochloride | Thermo Scientific | AM9856 |
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