Gebruik van Kristalviolet om visueel cytopathisch effectgebaseerd lezen voor virale titratie te verbeteren met behulp van TCID50-testen
Summary
Dit protocol toont een nauwkeurige en objectieve benadering om virale titraties te visualiseren met behulp van kristalviolet, door het te vergelijken met optische microscopie en immunocytochemische kleuring.
Abstract
Virale titratie is een belangrijke test voor virologisch onderzoek. De detectie van cytopathisch effect (CPE) via TCID50-assays en plaquevormende eenheden (PFU) -assays zijn de twee belangrijkste methoden om de titer van een virusvoorraad te berekenen en zijn vaak gebaseerd op microscopiedetectie of celkleuring voor visualisatie. In het geval van de TCID50-test is objectieve visualisatie gewoonlijk gebaseerd op immunocytochemische (ICC) kleuring van intracellulair virus om titers te berekenen in combinatie met visuele CPE-detectie via microscopie. ICC-kleuring is echter kostbaar en tijdrovend. In deze studie vergeleken we visuele CPE-observatie via microscopie, ICC-kleuring en kristalvioletkleuring om de titers van twee CPE-vormende virussen te bepalen, Influenza A-virus (IAV) van varkensoorsprong en Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome-virus (PRRSV). We laten zien dat zowel kristalviolet- als ICC-kleuring nauwkeuriger zijn dan visuele CPE-detectie, met bijna identieke precisieniveaus op zowel IAV als PRRSV. Om deze reden presenteren we hier kristalvioletkleuring als een snellere en meer betaalbare manier om virale titraties te bepalen op een TCID50-test voor CPE-vormende virussen getitreerd in cellijnen.
Introduction
Virale titratie via TCID50-test is een veelgebruikte techniek in onderzoek naar infectieziekten1. Hoewel variaties op de wiskunde achter deze methode in de loop van de tijd zijn voorgesteld1,2,3,4, zijn de momenteel toegepaste methoden voor infectiedetectie afhankelijk van visuele bevestiging door de aanwezigheid van cytopathisch effect (CPE) met behulp van microscopie5. Om CPE-visualisatie objectiever te bevestigen op TCID50-assays, is immunocytochemische (ICC) intracellulaire kleuring gericht op de eiwitten van het virus een van de meest gebruikte methoden6, omdat verschillende virussen verschillende vormen van CPE kunnen produceren. In ons geval zijn de celmorfologische veranderingen vergelijkbaar wanneer ze zijn geïnfecteerd met zowel influenza A-virus (IAV) als porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), waarbij geïnfecteerde cellen worden afgerond en loskomen van de plaat. In het geval van PRRSV veroorzaakt het een CPE die bekend staat als “totale vernietiging”, waarbij alle cellen uiteindelijk loskomen van de put. IAV daarentegen kan zowel totale vernietiging als een extra CPE presenteren die bekend staat als “subtotale vernietiging” waarbij een klein aantal cellen niet loskomt na infectie7. Deze techniek is echter tijdrovend om uit te voeren en vereist het gebruik van relatief dure reagentia. Het is belangrijk op te merken dat ICC cpe niet labelt, maar eerder het aantal cellen dat met succes door het virus is geïnfecteerd. Dit impliceert dat de cellen die aan het einde van de incubatie met succes zijn geïnfecteerd, als positief worden beschouwd, zelfs als de infectie nog geen CPE heeft veroorzaakt, en dus wordt een hoger percentage ICC-positieve cellen in vergelijking met CPE verwacht. Om die reden beschrijven we in deze studie een complementaire methode van visuele detectie van CPE in een TCID50-assay op basis van kristalviolet, een chemische stof met een positieve lading die zich hecht aan celmembranen en wordt gebruikt om aanhangende cellen te kleuren. Kristalviolet wordt vaak gebruikt in virologisch onderzoek om plaquevormende eenheden te meten, onder andere8.
In deze studie vergelijken we de gevoeligheid van niet-gekleurde microscopie CPE-detectie met kristalviolette kleuring en immunocytochemische kleuring op basis van virale eiwitherkenning, waarvan bekend is dat deze objectiever is vanwege de hoge gevoeligheid. Deze studie toont aan dat zowel kristalviolet als immunocytochemische kleuring nauwkeuriger zijn dan op visuele microscopie gebaseerde CPE-detectie en kan worden gebruikt om geïnfecteerde putten objectief te identificeren in een TCID50-titratie. Gezien hun vermogen om bijna identiek niveau van nauwkeurigheid te bereiken op de cytopathische virussen die in cellijnen zijn getest, wordt kristalviolet gepresenteerd als een snellere en meer betaalbare manier om virale titraties te bepalen op een TCID50-test. De voorgestelde methode met kristalvioletkleuring duurt een totale tijd van 40 minuten om uit te voeren, met 15 minuten voor paraformaldehyde (PFA) incubatie, 5 minuten voor kristalviolette incubatie en maximaal 15 minuten voor materiaalvoorbereiding, bufferwassingen en drogen. Het immunocytochemische protocol dat wordt toegepast voor vergelijking duurt een gemiddelde tijd van 4 h 30 min en werd uitgevoerd zoals eerder beschreven9,10. De voorgestelde methode is bedoeld om een voltooide virale titratie te helpen visualiseren. Infectie- en incubatietijden kunnen worden uitgevoerd met verschillende lay-outs, afhankelijk van het virus. Hier testten we twee RNA-virussen met cytopathisch effect op cellijnen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Virale titraties worden routinematig gebruikt in virologisch onderzoek, met PFU-detectie en TCID50-assays die het meest worden gebruikt1,2,3,4. Beide methoden zijn gebaseerd op de detectie van CPE in geïnfecteerde cellen, en hoewel ze visueel kunnen worden beoordeeld via microscopie, wordt een kleuring meestal toegepast om een objectiever resultaat te verkrijgen of zelfs de incubatiet…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Auteurs willen graag Dr. Frank Scholle bedanken voor zijn nuttige opmerkingen in het manuscript, Chloe Mariant voor haar hulp bij de microscopiebeelden en Teresa M. Tiedge voor haar behulpzame Engelse revisie.
Materials
| 96-well cell culture plates | Genesee | 25-221 | Clear, flat bottom |
| AEC solution | Thermo Fisher | 1122 | |
| Crystal violet | Thermo Fisher | C581-25; C581-100 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum | BioWest | S1480 | |
| Paraformaldehide | Thermo Fisher | J19943 | |
| Primary Influenza Antibody | Bioss | BS-0344R | |
| Primary PRRSV Antibody | Bioss | BS-10043R | |
| Saponin | Thermo Scientific | AAA1882014 | |
| Secondaty antibody | Invitrogen | 31460 | |
| Tris Hydrochloride | Thermo Scientific | AM9856 |
Riferimenti
- Kärber, G. Contribution to the collective treatment of pharmacological series experiments. Naunyn-Schmiedeberg’s Archive for Experimental Pathology and Pharmacology. 162 (4), 480-483 (1931).
- Ramakrishnan, M. A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World Journal of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).
- Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty per cent endpoints. American Journal of Epidemiology. 27 (3), 493-497 (1938).
- Spearman, C. The method of right and wrong cases (constant stimuli) without Gauss’s formulae. British Journal of Psychology. 2 (3), 227 (1908).
- Darling, A. J., Boose, J. A., Spaltro, J. Virus assay methods: accuracy and validation. Biologicals. 26 (2), 105-110 (1998).
- Kim, J., Chae, C. A comparison of virus isolation, polymerase chain reaction, immunohistochemistry, and in situ hybridization for the detection of porcine circovirus 2 and porcine parvovirus in experimentally and naturally coinfected pigs. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 16 (1), 45-50 (2004).
- Suchman, E., Blair, C. Cytopathic effects of viruses protocols. American Society of Microbiology. , (2007).
- Karakus, U., Crameri, M., Lanz, C., Yángüez, E. . Influenza Virus. , 59-88 (2018).
- Tingstedt, J. -. E., Nielsen, J. Cellular immune responses in the lungs of pigs infected in utero with PRRSV: an immunohistochemical study. Viral Immunology. 17 (4), 558-564 (2004).
- Guarner, J., et al. Immunohistochemical and in situ hybridization studies of influenza A virus infection in human lungs. American Journal of Clinical Pathology. 114 (2), 227-233 (2000).
- Nicholls, J. M., et al. Detection of highly pathogenic influenza and pandemic influenza virus in formalin fixed tissues by immunohistochemical methods. Journal of Virological Methods. 179 (2), 409-413 (2012).
