Utilisation de Crystal Violet pour améliorer la lecture visuelle basée sur les effets cytopathiques pour la tittration virale à l’aide des tests TCID50
Summary
Ce protocole montre une approche précise et objective pour visualiser les titrages viraux à l’aide de violet cristallin, en le comparant à la microscopie optique et à la coloration immunocytochimique.
Abstract
La titration virale est un test clé pour la recherche en virologie. La détection de l’effet cytopathique (CPE) via les tests TCID50 et les tests d’unités formant de plaque (PFU) sont les deux principales méthodes pour calculer le titre d’un stock de virus et sont souvent basées sur la détection par microscopie ou la coloration cellulaire pour la visualisation. Dans le cas du test TCID50, la visualisation objective est généralement basée sur la coloration immunocytochimique (ICC) du virus intracellulaire pour calculer les titres combinés à la détection visuelle du CPE par microscopie. Cependant, la coloration ICC est coûteuse et prend beaucoup de temps. Dans cette étude, nous avons comparé l’observation visuelle du CPE par microscopie, la coloration ICC et la coloration violette cristalline pour déterminer les titres de deux virus formant des CPE, le virus de la grippe A (IAV) d’origine porcine et le virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin (SDRP). Nous montrons que la coloration au violet cristallin et à l’ICC est plus précise que la détection visuelle du CPE, présentant des niveaux de précision presque identiques sur l’IAV et le PRRSV. Pour cette raison, nous présentons ici la coloration violette cristalline comme un moyen plus rapide et plus abordable de déterminer les titrages viraux sur un test TCID50 pour les virus formant des CPE titrés dans des lignées cellulaires.
Introduction
La titration virale par dosage TCID50 est une technique couramment utilisée dans la recherche sur les maladies infectieuses1. Bien que des variations sur les mathématiques derrière cette méthode aient été proposées au fil du temps1,2,3,4, les méthodes actuellement appliquées de détection des infections reposent sur la confirmation visuelle par la présence d’effet cytopathique (CPE) à l’aide de la microscopie5. Pour confirmer la visualisation du CPE de manière plus objective sur les tests TCID50, la coloration intracellulaire immunocytochimique (ICC) ciblant les protéines du virus est l’une des méthodes les plus couramment utilisées6, car différents virus peuvent produire différentes formes de CPE. Dans notre cas, les changements morphologiques cellulaires sont similaires lorsqu’ils sont infectés à la fois par le virus de la grippe A (IAV) et le virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin (SDRP), où les cellules infectées s’arrondissent et se détachent de la plaque. Dans le cas du SDRP, il provoque un CPE connu sous le nom de « destruction totale », où toutes les cellules finissent par se détacher du puits. D’autre part, l’IAV peut présenter à la fois une destruction totale et un CPE supplémentaire connu sous le nom de « destruction sous-totale » où un petit nombre de cellules ne se détachent pas après l’infection7. Cependant, cette technique prend beaucoup de temps à réaliser et nécessite l’utilisation de réactifs relativement coûteux. Il est important de noter que l’ICC n’étiquette pas le CPE, mais plutôt le nombre de cellules infectées avec succès par le virus. Cela implique que les cellules qui ont été infectées avec succès à la fin de l’incubation seront considérées comme positives même si l’infection n’a pas encore causé de CPE, et donc, un pourcentage plus élevé de cellules ICC positives par rapport à CPE est attendu. Pour cette raison, dans cette étude, nous décrivons une méthode complémentaire de détection visuelle du CPE dans un test TCID50 à base de violet cristallin, un produit chimique à charge positive qui se fixe aux membranes cellulaires et est utilisé pour colorer les cellules adhérentes. Le violet cristallin est souvent utilisé dans la recherche en virologie pour mesurer les unités formant la plaque, entre autres8.
Dans cette étude, nous comparons la sensibilité de la détection de CPE par microscopie non colorée avec la coloration violette cristalline et la coloration immunocytochimique basée sur la reconnaissance des protéines virales, qui est connue pour être plus objective en raison de sa sensibilité élevée. Cette étude montre que le violet cristallin et la coloration immunocytochimique sont plus précis que la détection CPE basée sur la microscopie visuelle et peuvent être utilisés pour identifier objectivement les puits infectés dans un titrage TCID50. Compte tenu de leur capacité à atteindre un niveau de précision presque identique sur les virus cytopathiques testés dans les lignées cellulaires, le violet cristallin est présenté comme un moyen plus rapide et plus abordable de déterminer les titrages viraux sur un test TCID50. La méthode proposée utilisant la coloration violette cristalline prend un temps total de 40 minutes à effectuer, avec 15 minutes pour l’incubation du paraformaldéhyde (PFA), 5 minutes pour l’incubation du violet cristallin et un maximum de 15 minutes pour la préparation du matériau, les lavages tampons et le séchage. Le protocole d’immunocytochimie appliqué pour la comparaison prend un temps moyen de 4 h 30 min et a été effectué comme décrit précédemment9,10. La méthode proposée vise à aider à visualiser un titrage viral terminé. Les temps d’infection et d’incubation peuvent être effectués avec une disposition différente en fonction du virus. Ici, nous avons testé deux virus à ARN ayant un effet cytopathique sur les lignées cellulaires.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les titrages viraux sont couramment utilisés dans la recherche en virologie, la détection de l’UFC et les tests TCID50 étant les plus couramment utilisés1,2,3,4. Les deux méthodes reposent sur la détection du CPE dans les cellules infectées, et même si elles peuvent être évaluées visuellement par microscopie, une coloration est généralement appliquée pour obtenir un ré…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier le Dr Frank Scholle pour ses commentaires utiles dans le manuscrit, Chloe Mariant pour son aide avec les images de microscopie et Teresa M. Tiedge pour sa révision utile en anglais.
Materials
| 96-well cell culture plates | Genesee | 25-221 | Clear, flat bottom |
| AEC solution | Thermo Fisher | 1122 | |
| Crystal violet | Thermo Fisher | C581-25; C581-100 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum | BioWest | S1480 | |
| Paraformaldehide | Thermo Fisher | J19943 | |
| Primary Influenza Antibody | Bioss | BS-0344R | |
| Primary PRRSV Antibody | Bioss | BS-10043R | |
| Saponin | Thermo Scientific | AAA1882014 | |
| Secondaty antibody | Invitrogen | 31460 | |
| Tris Hydrochloride | Thermo Scientific | AM9856 |
Riferimenti
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