Verwendung von Crystal Violet zur Verbesserung des visuellen zytopathischen Effekt-basierten Lesens für die virale Titration mit TCID50-Assays
Summary
Dieses Protokoll zeigt einen genauen und objektiven Ansatz zur Visualisierung viraler Titrationen unter Verwendung von Kristallviolett, indem es mit optischer Mikroskopie und immunzytochemischer Färbung verglichen wird.
Abstract
Die virale Titration ist ein Schlüsseltest für die virologische Forschung. Der Nachweis des zytopathischen Effekts (CPE) über TCID50-Assays und Plaque-bildende Einheiten (PFU)-Assays sind die beiden Hauptmethoden zur Berechnung des Titers eines Virusbestandes und basieren häufig auf mikroskopischem Nachweis oder Zellfärbung zur Visualisierung. Im Falle des TCID50-Assays basiert die objektive Visualisierung üblicherweise auf der immunzytochemischen (ICC) Färbung des intrazellulären Virus, um Titer in Kombination mit visuellem CPE-Nachweis über die Mikroskopie zu berechnen. ICC-Färbungen sind jedoch kostspielig und zeitaufwendig. In dieser Studie verglichen wir die visuelle CPE-Beobachtung mittels Mikroskopie, ICC-Färbung und Kristallviolettfärbung, um die Titer von zwei CPE-bildenden Viren zu bestimmen, dem Influenza-A-Virus (IAV) schweineischen Ursprungs und dem Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV). Wir zeigen, dass sowohl die Kristallviolett- als auch die ICC-Färbung genauer sind als die visuelle CPE-Detektion und sowohl bei IAV als auch bei PRRSV nahezu identisch genau sind. Aus diesem Grund präsentieren wir hier die Kristallviolettfärbung als eine schnellere und kostengünstigere Möglichkeit, virale Titrationen auf einem TCID50-Assay für CPE-bildende Viren zu bestimmen, die in Zelllinien titriert sind.
Introduction
Die virale Titration mittels TCID50-Assay ist eine häufig verwendete Technik in der Infektionsforschung1. Obwohl im Laufe der Zeit Variationen der Mathematik hinter dieser Methode vorgeschlagen wurden1,2,3,4, beruhen die derzeit angewandten Methoden des Infektionsnachweises auf der visuellen Bestätigung durch das Vorhandensein eines zytopathischen Effekts (CPE) unter Verwendung der Mikroskopie5. Um die CPE-Visualisierung objektiver auf TCID50-Assays zu bestätigen, ist die immunzytochemische (ICC) intrazelluläre Färbung, die auf die Proteine des Virus abzielt, eine der am häufigsten verwendeten Methoden6, da verschiedene Viren unterschiedliche Formen von CPE produzieren können. In unserem Fall sind die morphologischen Veränderungen der Zellen ähnlich, wenn sie sowohl mit dem Influenza-A-Virus (IAV) als auch mit dem Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV) infiziert sind, bei dem sich infizierte Zellen zusammenballen und von der Platte lösen. Im Fall von PRRSV verursacht es eine CPE, die als “totale Zerstörung” bekannt ist, bei der sich alle Zellen vom Brunnen lösen. IAV hingegen kann sowohl eine totale Zerstörung als auch eine zusätzliche CPE darstellen, die als “subtotale Zerstörung” bekannt ist, bei der sich eine kleine Anzahl von Zellen nach der Infektion nicht löst7. Diese Technik ist jedoch zeitaufwendig und erfordert die Verwendung relativ kostspieliger Reagenzien. Es ist wichtig zu beachten, dass ICC nicht CPE kennzeichnet, sondern die Anzahl der Zellen, die erfolgreich mit dem Virus infiziert wurden. Dies bedeutet, dass die Zellen, die am Ende der Inkubation erfolgreich infiziert wurden, auch dann als positiv angesehen werden, wenn die Infektion cpe noch nicht verursacht hat, und somit ein höherer Prozentsatz an ICC-positiven Zellen im Vergleich zu CPE erwartet wird. Aus diesem Grund beschreiben wir in dieser Studie eine komplementäre Methode zum visuellen Nachweis von CPE in einem TCID50-Assay auf der Basis von Kristallviolett, einer Chemikalie mit einer positiven Ladung, die an Zellmembranen bindet und zur Färbung anhaftender Zellen verwendet wird. Kristallviolett wird häufig in der virologischen Forschung verwendet, um unter anderem plaquebildende Einheiten zu messen8.
In dieser Studie vergleichen wir die Sensitivität der nicht gefärbten Mikroskopie-CPE-Detektion mit der Kristallviolettfärbung und der immunzytochemischen Färbung basierend auf viraler Proteinerkennung, von der bekannt ist, dass sie aufgrund ihrer hohen Empfindlichkeit objektiver ist. Diese Studie zeigt, dass sowohl die kristallviolette als auch die immunzytochemische Färbung genauer sind als die visuelle mikroskopische CPE-Detektion und zur objektiven Identifizierung infizierter Vertiefungen in einer TCID50-Titration verwendet werden können. Angesichts ihrer Fähigkeit, ein nahezu identisches Maß an Genauigkeit bei den in Zelllinien getesteten zytopathischen Viren zu erreichen, wird Crystal Violet als eine schnellere und kostengünstigere Möglichkeit zur Bestimmung von Virustitrationen auf einem TCID50-Assay präsentiert. Die vorgeschlagene Methode unter Verwendung der Kristallviolettfärbung benötigt eine Gesamtzeit von 40 minuten, mit 15 min für die Paraformaldehyd (PFA) -Inkubation, 5 min für die Kristallviolett-Inkubation und maximal 15 min für die Materialvorbereitung, Pufferwäsche und Trocknung. Das zum Vergleich verwendete immunzytochemische Protokoll dauert durchschnittlich 4 h 30 min und wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt9,10. Die vorgeschlagene Methode zielt darauf ab, eine abgeschlossene virale Titration zu visualisieren. Infektions- und Inkubationszeiten können je nach Virus mit unterschiedlichem Layout durchgeführt werden. Hier haben wir zwei RNA-Viren mit zytopathischer Wirkung auf Zelllinien getestet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Virale Titrationen werden routinemäßig in der virologischen Forschung verwendet, wobei PFU-Nachweis und TCID50-Assays am häufigsten verwendet werden1,2,3,4. Beide Methoden beruhen auf dem Nachweis von CPE in infizierten Zellen, und obwohl sie visuell durch Mikroskopie beurteilt werden können, wird in der Regel eine Färbung angewendet, um ein objektiveres Ergebnis zu erhalten oder …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Dr. Frank Scholle für seine hilfreichen Kommentare im Manuskript, Chloe Mariant für ihre Hilfe bei den Mikroskopiebildern und Teresa M. Tiedge für ihre hilfreiche englische Überarbeitung.
Materials
| 96-well cell culture plates | Genesee | 25-221 | Clear, flat bottom |
| AEC solution | Thermo Fisher | 1122 | |
| Crystal violet | Thermo Fisher | C581-25; C581-100 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum | BioWest | S1480 | |
| Paraformaldehide | Thermo Fisher | J19943 | |
| Primary Influenza Antibody | Bioss | BS-0344R | |
| Primary PRRSV Antibody | Bioss | BS-10043R | |
| Saponin | Thermo Scientific | AAA1882014 | |
| Secondaty antibody | Invitrogen | 31460 | |
| Tris Hydrochloride | Thermo Scientific | AM9856 |
Riferimenti
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