Uso di Crystal Violet per migliorare la lettura basata sull'effetto citopatico visivo per la titolazione virale utilizzando i saggi TCID50
Summary
Questo protocollo mostra un approccio accurato e oggettivo per visualizzare le titolazioni virali utilizzando il viola cristallino, confrontandolo con la microscopia ottica e la colorazione immunocitochimica.
Abstract
La titolazione virale è un test chiave per la ricerca virologica. Il rilevamento dell’effetto citopatico (CPE) tramite saggi TCID50 e saggi di unità di formazione della placca (PFU) sono i due metodi principali per calcolare il titolo di un virus e sono spesso basati sul rilevamento al microscopio o sulla colorazione cellulare per la visualizzazione. Nel caso del test TCID50, la visualizzazione oggettiva si basa comunemente sulla colorazione immunocitochimica (ICC) del virus intracellulare per calcolare i titoli combinati con il rilevamento visivo cpe tramite microscopia. Tuttavia, la colorazione ICC è costosa e richiede tempo. In questo studio, abbiamo confrontato l’osservazione visiva della CPE tramite microscopia, la colorazione ICC e la colorazione viola cristallina per determinare i titoli di due virus che formano CPE, il virus dell’influenza A (IAV) di origine suina e il virus della sindrome riproduttiva e respiratoria suina (PRRSV). Mostriamo che sia la colorazione viola cristallo che icc sono più accurate del rilevamento visivo CPE, presentando livelli di precisione quasi identici sia su IAV che su PRRSV. Per questo motivo, qui presentiamo la colorazione viola cristallina come un modo più rapido e conveniente per determinare le titolazioni virali su un test TCID50 per virus che formano CPE titolati in linee cellulari.
Introduction
La titolazione virale tramite test TCID50 è una tecnica comunemente usata nella ricerca sulle malattie infettive1. Sebbene nel tempo siano state proposte variazioni sulla matematica alla base di questo metodo1,2,3,4, i metodi attualmente applicati di rilevamento delle infezioni si basano sulla conferma visiva attraverso la presenza di effetto citopatico (CPE) utilizzando la microscopia5. Per confermare la visualizzazione CPE in modo più obiettivo sui saggi TCID50, la colorazione intracellulare immunocitochimica (ICC) che prende di mira le proteine del virus è uno dei metodi più comunemente usati6 in quanto diversi virus possono produrre varie forme di CPE. Nel nostro caso, i cambiamenti morfologici cellulari sono simili quando infettati sia dal virus dell’influenza A (IAV) che dal virus della sindrome riproduttiva e respiratoria suina (PRRSV), in cui le cellule infette si arrotondano e si staccano dalla piastra. Nel caso del PRRSV, provoca un CPE noto come “distruzione totale”, in cui tutte le cellule finiscono per staccarsi dal pozzo. IAV, d’altra parte, può presentare sia la distruzione totale che un CPE aggiuntivo noto come “distruzione subtotale” in cui un piccolo numero di cellule non si stacca dopo l’infezione7. Tuttavia, questa tecnica richiede molto tempo per essere eseguita e richiede l’uso di reagenti relativamente costosi. È importante notare che ICC non etichetta CPE, ma piuttosto il numero di cellule infettate con successo dal virus. Ciò implica che le cellule che sono state infettate con successo alla fine dell’incubazione saranno viste come positive anche se l’infezione non ha ancora causato CPE e, quindi, si prevede una percentuale più elevata di cellule POSITIVE ICC rispetto a CPE. Per questo motivo, in questo studio descriviamo un metodo complementare di rilevamento visivo del CPE in un test TCID50 basato sul viola cristallino, una sostanza chimica con una carica positiva che si attacca alle membrane cellulari e viene utilizzata per macchiare le cellule aderenti. Il viola cristallino è spesso utilizzato nella ricerca virologica per misurare le unità di formazione della placca, tra gli altri8.
In questo studio, confrontiamo la sensibilità del rilevamento CPE al microscopio non colorato con la colorazione viola cristallina e la colorazione immunocitochimica basata sul riconoscimento delle proteine virali, che è noto per essere più obiettivo a causa della sua elevata sensibilità. Questo studio dimostra che sia la colorazione viola cristallina che quella immunocitochimica sono più accurate del rilevamento CPE basato sulla microscopia visiva e possono essere utilizzate per identificare oggettivamente i pozzetti infetti in una titolazione TCID50. Data la loro capacità di raggiungere un livello quasi identico di accuratezza sui virus citopatici testati in linee cellulari, il viola cristallino è presentato come un modo più veloce e conveniente per determinare le titolazioni virali su un test TCID50. Il metodo proposto che utilizza la colorazione viola cristallina richiede un tempo totale di 40 minuti per l’esecuzione, con 15 minuti per l’incubazione della paraformaldeide (PFA), 5 minuti per l’incubazione del viola cristallino e un massimo di 15 minuti per la preparazione del materiale, i lavaggi tampone e l’essiccazione. Il protocollo immunocitochimico applicato per il confronto richiede un tempo medio di 4 h 30 min ed è stato eseguito come descritto in precedenza9,10. Il metodo proposto mira a visualizzare una titolazione virale completata. I tempi di infezione e incubazione possono essere eseguiti con layout diversi a seconda del virus. Qui abbiamo testato due virus a RNA con effetto citopatico sulle linee cellulari.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le titolazioni virali sono abitualmente utilizzate nella ricerca virologica, con il rilevamento PFU e i saggi TCID50 più comunemente usati1,2,3,4. Entrambi i metodi si basano sul rilevamento di CPE nelle cellule infette e, anche se possono essere valutati visivamente tramite microscopia, di solito viene applicata una colorazione per ottenere un risultato più obiettivo o addirittura p…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrebbero ringraziare il Dr. Frank Scholle per i suoi utili commenti nel manoscritto, Chloe Mariant per il suo aiuto con le immagini al microscopio e Teresa M. Tiedge per la sua utile revisione in inglese.
Materials
| 96-well cell culture plates | Genesee | 25-221 | Clear, flat bottom |
| AEC solution | Thermo Fisher | 1122 | |
| Crystal violet | Thermo Fisher | C581-25; C581-100 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum | BioWest | S1480 | |
| Paraformaldehide | Thermo Fisher | J19943 | |
| Primary Influenza Antibody | Bioss | BS-0344R | |
| Primary PRRSV Antibody | Bioss | BS-10043R | |
| Saponin | Thermo Scientific | AAA1882014 | |
| Secondaty antibody | Invitrogen | 31460 | |
| Tris Hydrochloride | Thermo Scientific | AM9856 |
Riferimenti
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