TCID50アッセイを用いたウイルス滴定のための視覚細胞パシー効果ベースの読取を改善するための結晶バイオレットの使用
Summary
このプロトコルは、光学顕微鏡法および免疫細胞化学染色と比較することにより、結晶バイオレットを用いてウイルス滴定を可視化する正確かつ客観的なアプローチを示す。
Abstract
ウイルス滴定は、ウイルス学研究の重要なアッセイです。TCID50アッセイおよびプラーク形成単位(PFU)アッセイ による 細胞パシー効果(CPE)の検出は、ウイルスストックの力量を計算する2つの主要な方法であり、多くの場合、可視化のための顕微鏡検査検出または細胞染色に基づいています。TCID50アッセイの場合、客観的可視化は、一般に 、細胞内 ウイルスの免疫細胞化学(ICC)染色に基づいて、顕微鏡による視覚的CPE検出と組み合わせた力素を計算する。しかし、ICC染色はコストがかかり、時間がかかります。本研究では、顕微鏡、ICC染色、結晶紫色染色 を用いた 視覚的CPE観察を比較し、豚由来のインフルエンザAウイルス(IAV)と豚生殖呼吸器症候群ウイルス(PRRSV)の2つのCPE形成ウイルスの強気体を決定した。我々は、結晶バイオレットとICC染色の両方が視覚的なCPE検出よりも正確であり、IAVとPRRSVの両方でほぼ同じレベルの精度を示していることを示す。このため、ここでは、細胞株に滴定されたCPE形成ウイルスに対するTCID50アッセイのウイルス滴定を迅速かつ手頃な価格で測定する方法として、結晶紫色染色を提示する。
Introduction
TCID50アッセイを介したウイルス滴定は、感染症研究1で一般的に使用される技術である。この方法の背後にある数学のバリエーションは、時間1、2、3、4の上に提案されているが、感染検出の現在適用されている方法は、顕微鏡5を使用してサイトパシー効果(CPE)の存在を通じて視覚的確認に依存している。TCID50アッセイでCPEの可視化をより客観的に確認するために、ウイルスのタンパク質を標的とする免疫細胞化学(ICC)細胞内染色は、異なるウイルスが様々な形態のCPEを産生することができるため、最も一般的に使用される方法の1つである。我々の場合、細胞形態学的変化は、インフルエンザAウイルス(IAV)と豚生殖および呼吸器症候群ウイルス(PRRSV)の両方に感染した場合に似ており、感染した細胞は切り上げられ、プレートから切り離される。PRRSVの場合、それはすべての細胞が井戸から剥離してしまう「総破壊」として知られているCPEを引き起こします。一方、IAVは、感染後に少数の細胞が剥離しない「小計破壊」として知られる総破壊と追加のCPEの両方を提示することができる7。しかし、この技術は実行に時間がかかり、比較的高価な試薬を使用する必要があります。ICCはCPEにラベルを付けるのではなく、ウイルスに感染した細胞の数に注意することが重要です。これは、インキュベーションの終わりまでに正常に感染した細胞は、感染がまだCPEを引き起こしていない場合でも陽性と見なされることを意味し、したがって、CPEと比較してICC陽性細胞のより高い割合が期待される。そのため、この研究では、細胞膜に付着し、接着細胞を染色するために使用される正の電荷を有する化学物質である、結晶バイオレットに基づくTCID50アッセイにおけるCPEの視覚的検出の相補的な方法を説明する。クリスタルバイオレットは、プラーク形成ユニットを測定するためにウイルス学の研究でしばしば利用され、とりわけ8。
本研究では、非染色顕微鏡CPE検出の感度を、高感度に起因する目的が高いことが知られているウイルスタンパク質認識に基づく結晶バイオレット染色および免疫細胞化学的染色と比較した。この研究は、結晶紫と免疫細胞化学染色の両方が視覚的な顕微鏡ベースのCPE検出よりも正確であり、TCID50滴定で感染した井戸を客観的に同定するために使用できることを示している。細胞株でテストされた細胞質ウイルスにほぼ同じレベルの精度に達する能力を考えると、結晶バイオレットはTCID50アッセイ上のウイルス滴定を決定するためのより速く、より手頃な方法として提示される。クリスタルバイオレット染色を使用した提案方法は、パラホルムアルデヒド(PFA)インキュベーションに15分、結晶バイオレットインキュベーションに5分、材料調製、緩衝液、乾燥のために最大15分で、実行するのに合計40分の時間がかかります。比較に適用される免疫細胞化学プロトコルは、平均時間4時間30分を要し、前述のとおりに行った。提案された方法は、完成したウイルス滴定を視覚化することを目的としている。感染および潜伏時間は、ウイルスに応じて異なるレイアウトで行うことができる。ここでは、細胞株に細胞性効果を有する2つのRNAウイルスを試験した。
Protocol
Representative Results
Discussion
ウイルス滴定はウイルス学研究で日常的に使用されており、PFU検出およびTCID50アッセイは最も一般的に使用される1,2,3,4です。どちらの方法も感染細胞のCPEの検出に依存しており、顕微鏡検査を介して視覚的に評価することができるにもかかわらず、通常、より客観的な結果を得るために、…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、原稿の中で彼の有用なコメントのためにフランク・ショール博士を認めたいと思います, 顕微鏡画像で彼女の助けのためのクロエ・マリアントと彼女の役に立つ英語の改訂のためのテレサ・M・ティッジ.
Materials
| 96-well cell culture plates | Genesee | 25-221 | Clear, flat bottom |
| AEC solution | Thermo Fisher | 1122 | |
| Crystal violet | Thermo Fisher | C581-25; C581-100 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum | BioWest | S1480 | |
| Paraformaldehide | Thermo Fisher | J19943 | |
| Primary Influenza Antibody | Bioss | BS-0344R | |
| Primary PRRSV Antibody | Bioss | BS-10043R | |
| Saponin | Thermo Scientific | AAA1882014 | |
| Secondaty antibody | Invitrogen | 31460 | |
| Tris Hydrochloride | Thermo Scientific | AM9856 |
Riferimenti
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